Ze względu na to, że pojedyncze nici DNA są stosunkowo stabilne w środowisku alkalicznym, denaturację przeprowadza się zazwyczaj właśnie w takich warunkach.

Temperatura topnienia DNA thumb|350px|Wyznaczenie temperatury topnienia kwasu nukleinowego z wykorzystaniem efektu hiperchromowego Wzrost temperatury DNA destabilizuje podwójną helisę, wywołując rozdzielenie nici. Ciepło zaburza zarówno wiązania wodorowe, jak i powłokę hydratacyjną, prowadząc do zmniejszenia sił utrzymujących obie nici razem. Eksperymentalnie stwierdzono liniową zależność między zawartością G+C a temperaturą rozdzielenia się nici DNA (rozdzielenie pary GC wymaga zerwania trzech wiązań wodorowych, a pary AT tylko dwóch). Temperatura ta jest wyższa dla dłuższych dupleksów; zależy także od modyfikacji obecnych w resztach nukleotydowych (które w zależności od swojego charakteru mogą ją podwyższać lub obniżać). Temperaturę, w której 50% składu próbki DNA ulega denaturacji, nazywa się temperaturą topnienia DNA (lub temperaturą mięknięcia DNA), Tm (taki sam parametr określa się dla dupleksów innych kwasów nukleinowych, na przykład RNA:RNA lub RNA:DNA).