Po ukończeniu praktyki podjął pracę u biskupa Treviso Bernarda de’Rossi, gdzie namalował kilka portretów i ołtarzy. Z tego okresu pochodzi m.in. obraz Dziewica z dzieciątkiem i św. Hieronimem (1506) (National Gallery of Scotland, Edinburgh) oraz Alegoria cnoty i Vice (1505) (National Gallery of Art, Waszyngton) z widocznymi wpływami malarstwa Giorgiona. W latach 1508–1510 przebywał w regionie Marche i Rzymie, gdzie tworzył u boku Rafaela. Następnie w latach 1513–1525 mieszkał w Bergamo. W tym czasie doskonalił swój warsztat w dziedzinie portretu, poznawał prace Gaudenzia Ferrariego i Correggia oraz upodabniał swój styl do wymogów zleceniodawców dokonując połączeń weneckich technik malarskich z tradycją lombardzką.
W latach dwudziestych Lotto namalował kilka portretów i obrazów ołtarzowych, w których przelał swoje poglądy na temat ówczesnych wydarzeń religijnych i narodzenia protestantyzmu. Charakteryzował się szerokimi, nierównymi pociągnięciami pędzla, pełnymi dynamizmu i ekspresji dziełami. Jest autorem kilku fresków w Bergamo, m.in. w oratorium Suardi w Trescore Balneario. W 1525 roku zamieszkał w Wenecji, gdzie – głównie za sprawą środowiska malarzy przychylnego twórczości Tycjana – przez kolejne 20 lat nie zyskał uznania. Tworzył w różnych regionach Włoch, dla zleceniodawców z Marche (Ołtarz św.