24 stycznia 2009 r. Margarito przegrał walkę z pretendentem do tytułu Shane’em Mosleyem przez techniczny nokaut w dziewiątej rundzie i stracił tytuł mistrza świata. Później wyszło na jaw, że przed walką na bandażach na rękach Margarito znaleziono nieznaną substancję która miała spowodować, że ciosy Meksykanina miały być mocniejsze. Nakazano mu ponownie obandażować ręce, a 24 lutego 2009 roku został pozbawiony licencji na okres jednego roku. Oznacza to, że w tym czasie nie wolno mu stoczyć żadnej walki na terenie Stanów Zjednoczonych, a po upływie tego okresu będzie musiał ponownie ubiegać się o przyznanie mu licencji.
Dalsza kariera Na ring powrócił 8 maja 2010 r., pokonując w Meksyku jednogłośnie na punkty Roberto Garcię, który już w pierwszej rundzie leżał na deskach. Dodatkowo sędzia odebrał Garcii po punkcie w rundzie ósmej (za uderzenie głową) oraz w dziesiątej (za ciosy poniżej pasa). 13 listopada 2010 roku stanął do pojedynku o wakujący pas WBC w wadze junior średniej, jego przeciwnikiem był Manny Pacquiao. Antonio przegrał zdecydowanie na punkty: sędziowie punktowali 109-119, 108-120, 110-118. Po walce Margarito został odwieziony do szpitala, gdzie przeszedł operację rekonstrukcji kości oczodołów.