Sprzeciwiła się kolejnym planom matrymonialnym ojca wobec niej.

Namiestniczka Niderlandów Po śmierci brata Filipa Pięknego Małgorzata 18 marca 1507 została namiestniczką Niderlandów. Ponadto była opiekunką bratanka Karola i jego sióstr Eleonory, Izabeli i Marii. Rezydencją Małgorzaty stało się Mechelen, gdzie wybudowała pałac. Na jej dworze przebywał m.in. Erazm z Rotterdamu. Celem jej polityki było odzyskanie Burgundii.

Po uznaniu przez stany burgundzkie bratanka Karola za pełnoletniego 5 stycznia 1515 Małgorzata utraciła urząd namiestniczki. W 1516 Karol objął tron hiszpański i w następnym roku mianował Małgorzatę ponownie na urząd namiestniczki. W 1529 zawarła ona z Ludwiką Sabaudzką pokój w Cambrai kończący wojnę pomiędzy królem Niemiec i Hiszpanii Karolem V a królem Francji Franciszkiem I. Pokój zawarły kobiety (matka króla Francji i ciotka władcy Niemiec), gdyż obaj władcy nie chcieli ze sobą rozmawiać.

thumb|Grób Małgorzaty w Brou W ostatnich latach życia cierpiała na chorobę nóg, zapewne na żylaki. Według innego przekazu miała ona nastąpić na odłamek szkła co spowodowało gangrenę (zgorzel) będącą przyczyną jej śmierci. Została pochowana początkowo w Brugii. W 1532 jej zwłoki przeniesiono do Brou i pochowano obok drugiego męża.

Przypisy