Profesor Kot uważa, że Stanisław Słupecki jeszcze przed synodem pińczowskim 10 sierpnia 1557 roku wprowadził nabożeństwa ewangelickie w kościołach w Opolu oraz filialnym w Kluczkowicach. Nie jest jednak ta data pewna, gdyż nawet księgi wizytacji biskupa Paniewskiego z 1565 roku oraz biskupa Jerzego Zamoyskiego z 1595 roku jej nie podają. Wspominają natomiast o sprofanowaniu kościoła w Opolu przez Stanisława Słupeckiego. Kalwini prowadzili w Opolu, w II połowie XVI wieku, swoją szkołę. Zdewastowano wnętrze kościoła parafialnego, a także zniszczono księgi parafialne, dzieła biblioteki, która wówczas istniała oraz akt erekcyjny kościoła.
Kościół obecny został zbudowany w latach 1650-1675, z fundacji rodziny Słupeckich. Jerzy Słupecki, który w 1644 roku przeszedł na katolicyzm, był pierwszym jego fundatorem. Następnie, gdy miasto przeszło w ręce rodziny Tarłów, to właśnie oni dokończyli dzieła budowy i wyposażenia świątyni. Kościół otrzymał wezwanie Wniebowzięcia Najświętszej Maryi Panny. Konsekrowany został w 1674 roku przez biskupa krakowskiego Andrzeja Trzebickiego.