Po zawarciu unii brzeskiej (1596) cerkiew w Siemiatyczach pozostawała prawosławną do 1614. Właściciel miasta Lew Sapieha, jako wielki kanclerz Księstwa Litewskiego, propagował unię kościelną wśród swoich poddanych. Prezenta z 1627 brzmi: „...prezentu dana królem według prawa patronatu pod warunkiem, że w Siemiatyczach będzie utrzymana unia.”. Lew Sapieha ufundował w Siemiatyczach nową cerkiew i uposażył ją w dobra wsi Rogawka i Sytki. W dokumencie z wizytacji biskupa unickiego z 1726 można przeczytać: „...pod tytułem Troycy Przenayśw... cerkiew drewniana. Na podgórku Cmętarz ma wkoło oparkaniony z dwoma... Dzwonnica osobno od Cerkwie słusznie opatrzona. Dach na cerkwie gatowy jeszcze się trzyma, kopuł dwie starych z krzyżami iuż opadających... Carskie Drzwi Snicerskiey Roboty pod pozłoto oprawne między kolumny porządne...”. Do cerkwi należały 4 włóki gruntu (jedna we wsi Boratyniec). W skład parafii w owym czasie wchodziło miasto Siemiatycze oraz wsie: Słochy, Klekotowo, Stare Słochy (Ogrodniki), Wołka, Ogrodniki Turniewskie, Turna (razem z kolonią), Boratyniec Ruski, Moszczona Młynarze, Baciki Bliższe, Baciki Zadnie, Srzednie, Czartajewo, Weremeyki, Hrycki, Czeczele, Klukowo, Rogawka – ogółem 425 domów, zamieszkałych przez 2511 osób. Z zapisków wizytacji z 1789 wiadomo, że cerkiew była już „...pod wezwaniem Śww.