Druga świątynia 23 września 1552 r. król Zygmunt August udzielił zezwolenia na odbudowę spalonego kościoła bernardynów, z zastrzeżeniem jego wysokości. Ze względów militarno-obronnych wieża kościoła miała być niższa, niż sąsiedni zamek. Mnisi uzyskali również dotację na odbudowę na mocy przywileju królewskiego Zygmunta Augusta. Obecny gotycko-renesansowy gmach kościoła pw. św. Jerzego powstał w latach 1552-1557 dzięki poparciu finansowemu rodziny Kościeleckich. Zmieniono wezwanie świątyni na Św. TrójcyKantak Kamil. Z przeszłości bernardynów bydgoskich. In. Przegląd Bydgoski Rocznik 1 R.1933 z.2.
10 września 1559 r. Sebastian z Żydowa, sufragan gnieźnieński, konsekrował ołtarz Św. Krzyża w kościele, zaś w 1563 r. gdański ludwisarz Herman Benincke odlał dla klasztoru wielki dzwon. Sklepienie kościoła wykonał o. Marcin z Bieganowa (zm. 1593). Przebudowa świątyni nastąpiła w latach 1590-1602. W tym czasie mieszczanin i szlachcic Stanisław Małżewski ufundował ołtarz Św. Krzyża w nowo wzniesionej kaplicy św. Anny po południowej stronie kościołakaplica ta zachowała się do dziś. W 1595 r. Dorota ze Spławskich, żona Jana Janusza Kościeleckiego, starosty bydgoskiego przyozdobiła kaplicę klasztorną polichromią i trzema zielonymi kilimami. W tym roku erygowano również przy ołtarzu Bractwo św.