W tej rundzie turniej kwalifikacyjny był podzielony na 2 części – dla mistrzów i niemistrzów poszczególnych federacji: do startu w rundzie play-off dla mistrzów uprawnionych było 10 drużyn (zwycięzców III rundy kwalifikacji dla mistrzów), z czego 5 było rozstawionych; do startu w rundzie play-off dla niemistrzów uprawnionych było 10 drużyn (w tym 5 zwycięzców III rundy kwalifikacji dla niemistrzów), z czego 5 było rozstawionych. Losowanie odbyło się 7 sierpnia 2009 (godz. 12:00). Pierwsze mecze rozegrano 18 i 19 sierpnia, rewanże – 25 i 26 sierpnia 2009. Spośród zespołów rozstawionych wyeliminowane zostały: Sporting CP, Panathinaikos AO, FC Kopenhaga oraz Lewski Sofia.
Drużyny, które wygrały w tej rundzie, otrzymały prawo gry w fazie grupowej Ligi Mistrzów UEFA. Drużyny, które przegrały w tej rundzie, otrzymały prawo gry w fazie grupowej Ligi Europy UEFA.
!colspan=6|Kwalifikacje dla mistrzów
!colspan=6|Kwalifikacje dla niemistrzów
Faza grupowa
Do startu w fazie grupowej uprawnione były 32 drużyny (w tym 10 zwycięzców rundy play-off). Losowanie odbyło się 27 sierpnia 2009 (godz. 18:00). W jego trakcie zespoły zostały rozdzielone na 4 koszyki, następnie rozlosowane i podzielone na 8 grup po 4 drużyny każda.