MSDOS.SYS – jeden z ważnych plików systemowych w MS-DOS oraz systemach operacyjnych z rodziny Windows 9x.
W wersjach MS-DOS od 1.1x do 6.22 plik ten zawiera jądro systemu operacyjnego i jest odpowiedzialny za dostęp do danych oraz zarządzanie oprogramowaniem. jest ładowany przez BIOS DOS jako część procedury rozruchu. W niektórych wersjach OEM systemu MS-DOS jest nazywany .
W systemach od Windows 95 (MS-DOS 7.0) do Windows Me (MS-DOS 8.0) jądro systemu DOS zostało połączone z BIOS-em DOS do jednego pliku, (znanego też jako ), zaś stał się zwykłym plikiem tekstowym zawierającym dyrektywy konfiguracyjne dotyczące rozruchu. W przypadku istnienia pliku to z niego system wczyta niezbędne dane zamiast z . Po zainstalowaniu systemu Windows 9x równolegle do już istniejącego systemu DOS, plik przynależący do Windows może zostać tymczasowo nazwany na czas pracy z wcześniejszym systemem. Podobnie plik starszego systemu może mieć zmienioną nazwę na tak długo jak uruchomiony jest Windows 9x.
Niektóre programy narzędziowe wymagają aby plik miał rozmiar co najmniej 1 KB.