Ezio darował mu życie, a sam wszedł do krypty, w której pojawił się hologram Minerwy – przedstawicielki cywilizacji poprzedzającej ludzi. Za pomocą Ezia porozumiewa się ona z Desmondem. Po tym templariusze atakują współczesną kryjówkę asasynów, a Desmond, Lucy, Shaun i Rebeka ładują animusa do ciężarówki i uciekają.

Akcja rozgrywa się w latach 1476-1499, 285 lat po wydarzeniach przedstawionych w pierwszej części. W Assassin’s Creed II ponownie pojawiają się postaci historyczne, tym razem są to rodzina Pazzich, Leonardo da Vinci, Niccolò Machiavelli, Katarzyna Sforza, Lorenzo de’ Medici, Girolamo Savonarola i Rodrigo Borgia.

Lokacje, które odwiedza bohater, to Florencja, San Gimignano, willa rodu Auditore w Monteriggioni, Wenecja, zamek Forlì oraz Rzym (głównie Watykan). Wśród odwzorowanych lokacji znajdują się m.in. bazylika św. Marka w Wenecji, nieskończona jeszcze katedra Santa Maria del Fiore, kanał Grande, most Rialto oraz wenecki Pałac Dożów.

Ubisoft stworzył również trzyodcinkowy serial Assassin’s Creed: Rodowód, przedstawiający historię poprzedzającą wydarzenia z gry.