Świat zwierząt Puszczy Niepołomickiej najdostojniej reprezentuje żubr, którego populacja rozrasta się zamkniętym Ośrodku Hodowli Żubrów w Niepołomicach. Zajmuje on powierzchnię około 69 ha, a stado żubrów liczy 24 sztuki. Gatunkami głównymi zwierzyny w puszczy są: jelenie, dziki, sarny oraz zwierzyna drobna: lisy, zające i bażanty. W skupiskach lasów liściastych pospolicie występują wiewiórki, stwierdza się również występowanie licznej grupy nietoperzy. Występuje tu również padalec zwyczajny oraz jaszczurka zwinka. Występowanie obfitego pokarmu i starodrzewu sprzyja gniazdowaniu ok. 40 gatunków ptaków. Świat owadów jest dość słabo poznany lecz wiadomo że na terenie Puszczy Niepołomickiej występuje kilka tysięcy gatunków.
Klimat Dno doliny Wisły leży przeciętnie na wysokości 200 m n.p.m. Średnia temperatura w dolinie Wisły wynosi 8 °C i obniża się w kierunku południowym. W ciągu roku liczba dni z przymrozkami waha się od 90 do 100 dni. Pierwsze przymrozki pojawiają się w połowie października, zaś ostatnie jeszcze pod koniec kwietnia. Największe zachmurzenie występuje od listopada do lutego, a maksymalne w grudniu. Największe nasłonecznienie występuje w lecie. Średnio słońce świeci przez około 5 godzin dziennie natomiast zimą 2.