Od 18 maja 1832 r. do 1 kwietnia 1838 r. przebywał w Australii. W okresie od stycznia do marca 1834 r. odbył podróż po Nowej Południowej Walii, w czasie której odkrył urodzajną dolinę Limestone i Rzekę Śnieżną (ang. Snowy River), a także jako pierwszy biały człowiek dotarł do Alp Australijskich. Jako pierwszy zebrał i opisał szereg gatunków górskiej flory Alp Australijskich. Notował również aborygeńskie nazwy miejscowe. Odkrycia swe opisał w siedmiu i pół (z 20 zaplanowanych) zeszytach (łącznie 118 stron) wydanych w latach 1834-1835 pod wspólnym tytułem A Journey from Sydney to the Australian Alps. W latach 1836–1838 pracował w Survey Office w Hobart na Tasmanii, gdzie zajmował się m.in. uzupełnianiem mapy geologicznej Półwyspu Tasmana. W tym czasie przez kilka miesięcy podróżował po ówczesnej Ziemi van Diemena. Zgromadził wówczas zbiór ok. 100 minerałów oraz 300 gatunków roślin występujących na wyspie, a także ułożył pierwszy słownik Aborygenów tasmańskich. Naukowa działalność Lhotsky’ego na niwie przyrodniczej została upamiętniona nazwą rodzajową roślin (Lhotskya) i nazwą rodzajową ryb z rodziny Belonowatych (Lhotskia).