Następnie sprawdza się, czy mRNA nie uległ degradacji. Można wykorzystać w tym celu bezkomórkowe systemy translacji (np. lizat retikulocytów królika) lub elektroforezę żelową. Do syntezy cDNA na matrycy mRNA wykorzystywany jest enzym odwrotna transkryptaza. Wymaga to startera, którym zwykle jest oligo(dT). Do syntezy drugiej nici, po zniszczeniu nici mRNA przez hydrolizę alkaliczną, można jako starter zastosować oligo(dG). Zwykle dokonuje się również obróbki końców cDNA, aby uzyskać lepkie końce ułatwiające wprowadzenie go do wektora.
cDNA są stosunkowo krótkie (0,5–10 kpz), dlatego do klonowania często stosuje się wektory plazmidowe. Do uzyskania dużej liczby klonów stosowane są również wektory pochodne faga λ, głównie do konstruowania ekspresyjnych bibliotek cDNA. Są to biblioteki zaprojektowane w taki sposób, aby zoptymalizować ekspresję wprowadzonego fragmentu DNA.
Przypisy
Bibliografia
Kategoria:DNA Kategoria:Biologia molekularna