W dniach 7–8 września 1901 klasztor formalnie rozpoczął działalność, zajmując budynki dawnego klasztoru dominikańskiego. Jego przełożoną została mniszka z monasteru w Leśnej, ihumenia Helena (Konowałowa). W pracy monasteru powtarzała ona wzory znane sobie z pracy macierzystego klasztoru. Klasztor w Krasnymstoku prowadził dwie szkoły „gramoty”, jedną szkołę dwuklasową, seminarium nauczycielskie dla kobiet oraz siedem szkół w okolicznych wsiach. Zakonnice prowadziły przytułek dla starszych kobiet, szpital, aptekę, sierociniec, posiadały znaczny majątek ziemski zaadaptowany na sady i ogrody z pasieką i stawami rybnymi. Prąd na potrzeby klasztoru wytwarzała jego własna dynamomaszyna. Mniszki prowadziły pracownię pisania ikon, warsztat krawiecki, introligatorski, tkacki i złotniczy, własny młyn i herbaciarnię. Własnością klasztoru był też jeden dom w Białymstoku. Na potrzeby licznych pielgrzymów wzniesiony został hotel. Ponadto w 1903 z inicjatywy ihumeni Heleny władze carskie otworzyły przystanek kolejowy w sąsiedztwie monasteru, by umożliwić pątnikom łatwiejsze docieranie do świątyń. Oprócz zaadaptowanego na cerkiew kościoła dominikanów, monaster posiadał dwie świątynie: św. Sergiusza z Radoneża (1901) i Zaśnięcia Matki Bożej (1908).