W czerwcu 1996 przeszedł do pracy w Kurii Rzymskiej. Został pro-prefektem Kongregacji Duchowieństwa i w związku z tą nominacją zrezygnował z rządów archidiecezją Bucamaranga. 21 lutego 1998 Jan Paweł II wyniósł go do godności kardynalskiej, nadając diakonię Santissimo Nome di Maria al Foro Traiano. Po nominacji kardynalskiej Castrillón Hoyos został pełnoprawnym prefektem Kongregacji Duchowieństwa, a w kwietniu 2000 objął dodatkowo funkcję prezydenta Papieskiej Komisji Ecclesia Dei. Reprezentował papieża na uroczystościach religijnych i rocznicowych w charakterze specjalnego wysłannika.

Po śmierci Jana Pawła II (2 kwietnia 2005) dalsze pełnienie przez kardynała Castrillóna Hoyosa funkcji prefekta Kongregacji Duchowieństwa i prezydenta Papieskiej Rady Ecclesia Dei uległo zawieszeniu; kardynał był wymieniany w gronie papabile, faworytów do następstwa po zmarłym papieżu na konklawe 2005. Nowy papież Benedykt XVI powierzył mu ponownie funkcję prefekta.

31 października 2006 papież przyjął jego rezygnację z funkcji prefekta Kongregacji Duchowieństwa (w związku z osiągnięciem przez kardynała wieku emerytalnego);