W 1821 przedstawił carowi Aleksandrowi I i Rosyjskiej Akademii Nauk plany ekspedycji z São Paulo do Pará, drogą rzeczną. W 1822 powrócił do Rio i razem z Édouardrm Ménétriesem, Ludwigiem Riedlem, Christianem Hassem i Nestorem Rubcowem zaczął przygotowania do wyprawy. W celu dokumentacji przebiegu wyprawy Langsdorff zaprosił do udziału malarzy: Hérculesa Florence'a, Johanna Moritza Rugendasa i Adriena Taunaya. Do członków wyprawy należał też Karl Drais.
Po długich przygotowaniach licząca 40 osób i wyposażona w siedem łodzi ekspedycja wyruszyła z Porto Feliz rzeką Tietê, i dotarła do Cuiabá w Mato Grosso 30 stycznia 1827. Tam podzieliła się na dwie ekspedycje: pierwsza, z Langsdorffem i Florencem, dotarła do Santarém nad Amazonką 1 lipca 1828, doświadczając po drodze wielu trudności (większość uczestników, w tym baron Langsdorff, zachorowało na tropikalną gorączkę, prawdopodobnie żółtą febrę). Adrien Taunay w styczniu 1828 utonął w rzece Guaporé. Obie ekspedycje ponownie się złączyły w Belém i powróciły statkiem do Rio de Janeiro, przybywając tam 13 marca 1829, po blisko trzech latach i 6000 km przebytej drogi.
Langsdorff powrócił do Europy w 1830.