W czasach wypraw krzyżowych władcy chrześcijańscy poczynili znaczące przeróbki w wewnętrznej strukturze świątyni, m.in. wymieniono stropy i dach, ściany ozdobiono mozaikami. Był to okres ekumenicznej współpracy królów jerozolimskich i bizantyjskiego dworu cesarskiego. Pierwszy król Jerozolimy Baldwin I z Boulogne był koronowany w bazylice w Uroczystość Bożego Narodzenia 1100 r. Po zdobyciu Ziemi Świętej, w tym Betlejem, w 1187 r. przez wojska Saladyna, na prośbę biskupa Salisbury Huberta Waltera zezwolono na sprawowanie łacińskiej liturgii w bazylice. Kult łaciński sprawowali kanonicy regularni św. Augustyna. W 1191 r. wprowadzono jednak stałą opłatę od wiernych. W 1347 r. w Betlejem osiedlili się franciszkanie i to oni przejęli opiekę nad sanktuarium. Liczne firmany poświadczają, iż to oni posiadali Grotę Narodzenia oraz używali i utrzymywali bazylikę w XIV i XV w. W XV w. franciszkanie zadbali o wymianę dachu. Drewno z Neapolu sprowadził gwardian betlejemski Giovanni Tomacelli. Przywieziono je statkami weneckimi do portu w Jafie. Za transport zapłacił Filip Dobry, książę Burgundii. Ołów na pokrycie dachu został podarowany przez króla Anglii Edwarda IV.