Nocna wersja bombowa była używana w 2 Pułku Nocnych Bombowców „Kraków”.
Po-2 były używane bojowo przez lotnictwo polskie także po wojnie. W ramach akcji „Wisła” w 1947 roku, do rozpoznawania położenia oddziałów UPA oraz do ich ostrzeliwania i bombardowania. Uzbrojenie polskich Po-2 stanowił karabin maszynowy SzKAS lub Diegtiariowa kal. 7,62 mm, obsługiwany przez obserwatora, który wyrzucał z kabiny również granaty F-1. thumb|Polski Po-2 uszkodzony podczas walk z UPA w Bieszczadach Samoloty typu Po-2 znajdowały się w uzbrojeniu polskiego lotnictwa wojskowego do 1950 roku. W lotnictwie cywilnym służyły do końca lat 60. XX wieku.
W latach 1950–1953 samoloty Po-2 były wykorzystywane lokalnie podczas wojny koreańskiej. Również na tym froncie okazało się, że samoloty te są bardzo trudne do zestrzelenia ze względu na małe rozmiary, konstrukcję drewnianą krytą płótnem, która bardzo słabo odbija promieniowanie radarowe, co utrudniało zlokalizowanie maszyn w przestrzeni przez amerykańskie myśliwce nocne.