Centrum Ochrony Mokradeł (dawniej Stowarzyszenie „Chrońmy Mokradła”), Greenpeace, Klub Przyrodników, Komitet Ochrony Orłów, Ogólnopolskie Towarzystwo Ochrony Ptaków, Polskie Towarzystwo Ochrony Przyrody „Salamandra”, Pracownia na rzecz Wszystkich Istot, Towarzystwo Przyrodnicze „Bocian”, WWF, Zielone Mazowsze), którzy wielokrotnie i w różny sposób protestowali przeciw projektowi poprowadzenia obwodnicy przez torfowiska w dolnym biegu Rospudy.
Przeciwko poprowadzeniu drogi przez Dolinę Rospudy protestowała też część naukowców: botaników, zoologów, specjalistów od ekologii, hydrologii i szaty roślinnej torfowiskList otwarty w sprawie Rospudy, podpisany przez 464 naukowców i przyrodników, m.in. Zbiór opinii i stanowisk ekspertów w sprawie wpływu budowy na przyrodę Doliny RospudyPoparcie Polskiego Towarzystwa Etologicznego dla akcji w obronie Doliny Rospudy.
Komisja Europejska, opierając się na dokumentacji projektu, zarzucała przedsięwzięciu szkodliwy wpływ na ornitofaunę stanowiącą przedmiot ochrony obszaru Natura 2000, niejasności w raporcie w odniesieniu do wpływu przedsięwzięcia na stosunki wodne oraz wadliwe przygotowanie programu kompensacji przyrodniczejUnijna opinia o inwestycjach drogowych na Podlasiu, Stavros Dimas, Komisja Wspólnot Europejskich, 2006.12.12, 2004/4713 K(2006) 6160.