Do miasta przybywa nowy prokonsul rzymski Sewerus, niegdyś związany uczuciami z Pauliną; jego zadaniem ma być zniszczenie rodzącej się gminy chrześcijańskiej. Akt II Kallistenes, kapłan Jowisza wprowadza Sewerusa do domu Feliksa, ojca Pauliny, by tworząc pozory jej zdrady zemścić się na niej za odrzucenie jego umizgów. Paulina odrzuca awanse Sewerusa, ale intryga Kallistenesa osiąga cel: Polieuktes jest przekonany, że żona zdradziła go z Rzymianinem. Nearkos zostaje aresztowany przez Rzymian, a kiedy torturami usiłują oni wydobyć od niego imię nowo ochrzczonego, Polieuktes sam wyznaje że to on i zostaje również wtrącony do więzienia. Akt III Paulina odwiedza Polieuktesa w więzieniu i oczyszcza się z podejrzeń o zdradę wyjawiając motywy, które kierowały Kallistenesem. Prosi męża, by wyparł się nowej wiary dla ratowania życia, on jednak odmawia. Budzi to w Paulinie wiarę i małżonkowie razem idą na męczeńską śmierć.
Historia utworu Donizetti skomponował 3-aktową operę Poliuto na prośbę tenora Adolphe’a Nourrita, który miał być pierwszym wykonawcą partii tytułowej.