Razem z Giuseppem Garibaldim stanął na czele ogólnowłoskiego powstania, które wybuchło w ramach Wiosny Ludów. Powstańcy, pod hasłem zjednoczenia ziem włoskich, rozpoczęli walkę o wyzwolenie spod panowania austriackiego. Poparcia udzielił im Karol Albert – władca Piemontu (Królestwa Sardynii), lecz jego wojska zostały pokonane przez Austriaków w 1849 r. w bitwie pod Novarą. Powstanie zostało stłumione przez wojska austriackie (na północy Włoch) i francuskie (w Państwie Kościelnym). Mazzini ponownie znajduje się na emigracji, skąd wspiera wszelkie podejmowane próby wyzwolenia narodowego. Jednak wypadki lat 1859–1860 nie odpowiadały jego oczekiwaniom, ponieważ w procesie tworzenia państwa włoskiego zwyciężyli monarchiści i umiarkowani.Jako niezłomny republikanin nie uznał Królestwa Włoskiego. „Zwycięski rewolucjonista przestaje być rewolucjonistą” – ostrzegał. Sam nigdy nie przestał być rewolucjonistą.
Był założycielem organizacji Młode Włochy, Lega Internazionale dei Popoli, Młoda Europa, Centralny Komitet Demokracji Europejskiej, Alleanza Republicana Universale. Mazzini wspierał polski ruch narodowowyzwoleńczy. Przyjaźnił się ze Stanisławem Worcellem, znał pisma Adama Mickiewicza, którego uważał za wielkiego poetę nowych czasów.