Hamowanie aktywności anhydrazy węglanowej prowadzi do niedoboru jonów wodorowych (podwyższenie pH) i wodorowęglanowych, co uniemożliwia wymianę sód–wodór. Rezultatem tego jest zwiększone wydalanie wody, jonów sodowych i wodorowęglanowych, co prowadzi do kwasicy metabolicznej, będącej jednak w dużym stopniu zjawiskiem samoograniczającym się. Do kanaliku dalszego dociera zwiększona ilość jonów sodu, co nasila wymianę /, czego następstwem może być hipokaliemia. Diuretyczne działanie acetazolamidu jest jednak krótkotrwałe – po 3 dniach stosowania zanikają jego właściwości moczopędne z powodu pojawienia się mechanizmów kompensacyjnych, niezależnych od anhydrazy węglanowej. Zahamowanie działania enzymu w wyrostkach rzęskowych w oku powoduje zmniejszenie ilości wytwarzanej cieczy wodnistej i spadek ciśnienia wewnątrzgałkowego. Efekty te, w przeciwieństwie do działania moczopędnego, są trwałe i nie ulegają zmianie w przypadku długotrwałego leczenia acetazolamidem. Acetazolamid jest również stosowany jako lek wspomagający w leczeniu padaczki i napadów nieświadomości. Hamowanie anhydrazy węglanowej w obrębie OUN opóźnia nieprawidłowe wyładowania neuronów. Ponadto acetazolamid zmniejsza wydzielanie płynu mózgowo-rdzeniowego.
Acetazolamid jest inhibitorem co najmniej czterech izoform anhydrazy węglanowej, m.in.