. W początkowym okresie miała charakter tymczasowy, a mandaty jej członków wygasały wraz z końcem pontyfikatu, ale ostatecznie 2 sierpnia 1564 papież Pius IV nadał jej stały charakter. 22 stycznia 1588 papież Sykstus V na trwałe włączył ją do struktur rządu papieskiego i przyznał jej honorowy prymat wśród pozostałych kongregacji kurialnych.
Działalność Kongregacji Świętego Oficjum w początkowym okresie koncentrowała się na zwalczaniu wpływów reformacji we Włoszech, w tym w szczególności wśród miejscowej hierarchii kościelnej. Na celowniku kardynałów inkwizytorów znalazło się wielu biskupów podejrzanych o sprzyjanie nowym ideom religijnym. W kręgu zainteresowań kardynałów inkwizytorów znaleźli się m.in. arcybiskup Otranto Pietro Antonio di Capua, biskup Chioggii Giacomo Nacchianti, biskup Capodistrii Pier Paolo Vergerio, patriarcha Akwilei Giovanni Grimani czy biskup Bergamo Vittore Soranzo. Nie wszystkich spośród nich Kongregacja zdołała doprowadzić przed swoje oblicze i skazać. Pier Paolo Vergerio wyjechał z Włoch i w 1550 został ostatecznie potępiony zaocznie. Z kolei biskup Nacchianti w 1549 zdołał oczyścić się z zarzutów.