2009 thumb|left|200px|Serena Williams podczas Australian Open 2009 Na początku nowego sezonu wystąpiła w Sydney. Rozstawiana z jedynką Serena w ćwierćfinale, broniąc dwóch piłek meczowych, pokonała Caroline Wozniacki 6:7,6:3,7:6. Półfinałowy mecz przegrała z Jeleną Diemientjewą 3:6,1:6.
W rozgrywanych w Melbourne Otwartych Mistrzostwach Australii zwyciężyła zarówno w grze pojedynczej (pokonując m.in. Swietłanę Kuźniecową oraz Jelenę Diemientjewą, zaś w finale nie dała szans Dinarze Safinie), jak i podwójnej, w parze z siostrą Venus. Po tym sukcesie awansowała na pierwszą pozycję w rankingu singlowym.
W półfinale Dubai Tennis Championships przegrała z Venus Williams. W Miami, broniąc tytułu wywalczonego rok wcześniej, odpadła w finale po słabym meczu z Wiktoryją Azarenką, wcześniej pokonunąc w czwartej rundzie Zheng Jie 7:5,5:7,6:3, w ćwierćfinale Li Nę 4:6, 7:5, 6:2, a w półfinale Venus Williams 6:4, 3:6, 6:3. W związku z nieobronieniem tytułu spadła z pierwszego miejsca w rankingu.
Słabą formę pokazywała podczas turniejów na kortach ziemnych. Dotarła do drugiej rundy w Rzymie i pierwszej w Madrycie. Z kolei na French Open przegrała w ćwierćfinale z późniejszą mistrzynią turnieju, Swietłaną Kuzniecową.