Na siedzibę szpitala wybrano pałac Mniszchów (ul. Senatorska 40), który zajmowała wówczas Warszawska Resursa Kupiecka. Komendantem Szpitala Maltańskiego został Stanisław Milewski-Lipkowski, zastępcą – Roman Chłapowski, naczelnym lekarzem został płk. dr Adam Huszcza. Siostrą Naczelną była Magdalena Lipkowska.
Pierwszych pacjentów przyjęto wieczorem 7 września, co było możliwe dzięki mieszkańcom Warszawy, którzy dostarczyli łóżka, pościel, sprzęt gospodarczy itp.. 8 września organizujący się jeszcze szpital został zbombardowany przez Luftwaffe.
Działalność przed powstaniem W okresie obrony Warszawy liczba pacjentów szybko rosła (do ok. 300 pod koniec września). Do dnia kapitulacji miasta (28 września 1939) były to głównie ofiary nalotów Luftwaffe. Rannych umieszczano w pałacu Mniszchów i w sąsiednich budynkach, m.in. w pałacu Błękitnym, należącym do Ordynacji Zamoyskich. Po kapitulacji Warszawy szpital został zaliczony do szpitali wojskowych, utrzymywanych – zgodnie z konwencją genewską – przez stronę zwycięską (nakazano przekazywanie pacjentów cywilnych do innych szpitali). Ograniczono liczbę łóżek do 190 (głównie chirurgia urazowa;