E. coli należy jednak do prokariotów, organizmów nieposiadających jądra komórkowego i innych organelli, funkcjonujących w odmienny sposób od komórek eukariotycznych. W związku z tym niektóre eukariotyczne geny mogą w nich nie funkcjonować prawidłowo, a wyprodukowane przez nie białka mogą nie być w pełni funkcjonalne. Dlatego też do klonowania DNA jako gospodarza używa się również trudniejsze do eksperymentowania eukarioty, od mikroorganizmów jak drożdże czy glony aż po komórki wielokomórkowych, złożonych organizmów. Manipulacje genetyczne u roślin wyższych i zwierząt mają często na celu stworzenie organizmu transgenicznego, rzadziej w celu służenia jako bioreaktor i produkcji dużych ilości określonego białka.
Jednym z najczęściej używanych eukariotów w inżynierii genetycznej są drożdże Saccharomyces cerevisiae. Poza tym używa się także grzybów Aspergillus nidulans, Neurospora crassa. W przypadku potrzeby użycia komórek roślinnych często wykorzystuje się jednokomórkową zielenicę Chlamydomonas reinhardtii – organizm łączący zalety mikroorganizmów z roślinną strukturą i organizacją komórek.