Jednakże aż do 1524/25 trybunał ten nie miał definitywnie ustalonej siedziby, przeważnie rezydując w Llerenie, Plasencii lub Meridzie. Jak wynika z zachowanych źródeł, inkwizytorzy dokonywali w tym okresie regularnych wizytacji całego regionu, ze szczególnym uwzględnieniem miejscowości o znacznym odsetku konwertytów żydowskiego pochodzenia (np. Badajoz, Fregenal de la Serra, Bejar, Guadalcanal). Około 1525 definitywnie ustalono siedzibę trybunału w miejscowości Llerena.
W pierwszym okresie działalności trybunału (1484–1537) jego głównym przedmiotem zainteresowania były liczne w Estremadurze społeczności marranów, które podejrzewano o potajemne wyznawanie judaizmu. Od około 1538 zainteresowanie inkwizytorów zwróciło się ku pilnowaniu ortodoksji tzw. starych chrześcijan (kastylijskiego pochodzenia), których zaczęto ścigać za stosunkowe drobne występki przeciw wierze i moralności (zwłaszcza za tzw. proposiciones, czyli nieortodoksyjne opinie wygłaszane przy różnych okazjach bez intencji szerzenia jakiegokolwiek odstępstwa religijnego). Procesy przeciw domniemanym judaizantom nadal stanowiły jednak znaczny odsetek spraw, a ponownie nasiliły się w latach 60. XVI wieku, gdy do Estremadury zaczęli przyjeżdżać marrani z Portugalii, uciekający przed tamtejszą inkwizycją.