W grze pojawia się wiele postaci historycznych, w tym m.in. Alcybiades, Archidamus II, Arystofanes, Aspazja, Brazydas, Eurypides, Kleon, Demokryt, Herodot, Hipokrates, Pauzaniasz, Perykles, Fidiasz, Platon, Poliklet, Praksilla, Pitagoras, Sokrates, Sofokles, Tespis i Ksantypa. Wśród miejsc historycznych, które odwiedza postać, znajdują się chociażby agora ateńska, Kefallonia, Itaka, odeon ateński, las Foloi, posąg Zeusa w Olimpii, Naksos, Lesbos, starożytne Ateny, Argolidę, Pnyks, Fokidę, Macedonię i Mesarę. Jako bossowie pojawiają się stworzenia znane z mitologii greckiej, chociażby Meduza, cyklop czy Minotaur, w grze przedstawiane jako eksperymenty prastarej rasy Isu, która według fabuły serii Assassin’s Creed stworzyła ludzkość.
Fabuła Rok 480 p.n.e. Król Leonidas I, stojący na czele Spartan, ściera się z armią perską podczas bitwy pod Termopilami. Pomimo początkowego sukcesu, spartańscy żołnierze zostają zdradzeni, otoczeni przez Persów i pokonani. W roku 2018 Layla Hassan odnajduje włócznię Leonidasa, z której udaje jej się odzyskać DNA wnucząt Leonidasa – Aleksiosa i Kasandry – które wykorzystuje, żeby zsynchronizować się z animusem i odnaleźć Berło Hermesa Trismegistusa.