Parker / Spider-Man, mentor Milesa Moralesa, który jest Spider-Manem z innego uniwersum. Hailee Steinfeld jako Gwen Stacy / Spider-Gwen, superbohaterka posiadająca pajęcze zdolności. Mahershala Ali jako Aaron Davis / Prowler, wujek Milesa Moralesa i przestępca pracujący dla Fiska. Brian Tyree Henry jako Jefferson Davis, ojciec Milesa Moralesa, policjant. Lily Tomlin jako May Parker, ciocia Petera Parkera, która w świecie w świecie Petera B. Parkera nie żyje, a w świecie Moralesa daje schronienie osobom z pajęczymi zdolnościami. Lauren Vélez jako Rio Morales, matka Milesa Moralesa, pielęgniarka. John Mulaney jako Peter Porker / Spider-Kwik, zwierzęca wersja Spider-Mana, która pochodzi z antropomorficznego świata. Jest on pająkiem ugryzionym przez radioaktywną świnię. Kimiko Glenn jako Peni Parker / SP//dr, nastolatka amerykańsko-japońskiego pochodzenia ze świata anime obsługująca biomechanicznego robota i posiadająca telepatyczną więź z radioaktywnym pająkiem. Nicolas Cage jako Peter Parker / Spider-Man Noir, wersja Spider-Mana z czarno-białego uniwersum lat trzydziestych XX wieku. Liev Schreiber jako Wilson Fisk / Kingpin, groźny przestępca i właściciel Alchemaxu.