Аденозин трифосфорната киселина (също аденозинтрифосфат или АТФ) представлява химично макроергично съединение, което съдържа богати на енергия връзки. Изграден е от 3 основни съставки: азотна база аденин, рибоза и 3 остатъка от фосфорна киселина, обозначени като алфа- (α), бета- (β), и за последния гама- (γ) фосфатен остатък. В неутрален разтвор йонизираният АТФ съществува предимно като ATP4− и малка част като ATP3−.
АТФ съдържа в молекулата си 2 макроенергични връзки, които при разкъсването си освобождават енергия за нуждите на организма (между α- и β-, и β- и γ- фосфатен остатък).
Свързване на метални катиони към АТФ Като полион, и притежаващ потенциално хелираща фосфатна група, АТФ свързва метални катиони с висок афинитет. Свързващата константа за Mg2+ е 9554. Свързването на двувалентения катион (почти винаги магнезиев) силно повлиява взаимодействието на АТФ с различни протеини. Поради силата на ATФ-Mg2+ взаимодействието, ATФ съществува в клетките почти изцяло в комплекс с Mg2+, свързан с фосфатните кислородни центрове.
Втори магнезиев йон е важен за АТФ свързването в киназните домени. Наличието на Mg2+ регулира киназната активност.
Химични характеристики Солите на ATФ могат да бъдат изолирани като безцветни твърди (не течни) вещества. Циклите на синтез и разграждане на АТФ 2 и 1 представляват внасяне и освобождаване на енергия, съответно АТФ е стабилен във воден разтвор при pH между 6,8 и 7,4, в отсъствието на катализатори. При по-екстремни pH стойности, бързо хидролизира до АДФ и фосфат. Живите организми поддържат съотношение на АТФ към АДФ в порядъка от 1:10. В контекста на биохимичните реакции, P-O-P връзките са връзки с висок групов потенциал (макроенергични връзки).
Хидролизата на АТФ до АДФ и неорганичен фосфат освобождава 30,5 kJ/mol енталпия, с промяна в свободната енергия 3,4 kJ/mol. Енергиите, освободени при разграждането на фосфат (Pγ) или пирофосфат (PPi) от АТФ, при стандартни условия за 1 М, са: ATP + H2O → ADP + Pi ΔG° = −30,5 kJ/mol (−7.3 kcal/mol) ATP + H2O → AMP + PPi ΔG° = −32,2 kJ/mol (−7,7 kcal/mol)
Тези съкратени уравнения могат да бъдат написани по-подробно (R = аденозил): [RO-P(O)2-O-P(O)2-O-PO3]4− + H2O → [RO-P(O)2-O-PO3]3− + [PO4]3− + 2 H+ [RO-P(O)2-O-P(O)2-O-PO3]4− + H2O → [RO-PO3]2− + [O3P-O-PO3]4− + 2 H+
Получаване АТФ може да се получи при разграждането на мазнини, белтъци (по-малко) и въглехидрати в основния метаболизъм на клетката. Основното количество АТФ се получава при окислителното фосфорилиране в митохондриите.
Синтезиране АТФ се синтезира в клетката при различни метаболитни пътища като (1) гликолиза, (2) цикъл на Кребс, дихателна верига/окислително фосфорилиране и бета-окисление. Като цяло процесът на окисление на глюкозата до въглероден диоксид се, комбинацията н апът 1, 2 и 3 се нарича аеробна гликолиза, продуцираща 30 (32) М АТФ по Hinkle за всяка молекула глюкоза, или още окислително фосфорилиране. В по-тесен смисъл на терминът окислително фосфорилиране означава фосфорилиране/синтез на АТФ от АДФ и Фн в присъствието на О2 в дихателните вериги на митохондриите, при пренос на редуциращи ексвиваленти Н2 от НАДН.Н и ФАДН2, субстрати на дихателната вериги и продукти на гликолиза (в тесен смисъл до пируват) и Цикъл на Кребс.
АТФ продукцията от не-фотосинтезиращите аеробни еукариоти се наблюдава основно в митохондриите, продуциращи около 90% от АТФ в клетките.
За едно денонощие в човешкия организъм се получават и използват около 100 – 150 мола АТФ (за 50 – 75 кг, т.е. колкото средното женско/мъжко тегло), като една молекула се ресинтезира стотици пъти в денонощие, моментното количество е около 250 грама, времето на съществуване на една молекула АТФ е минута.
Окислително фосфорилиране Всички биохимични реакции в организма се извършват с участие на ензим или ензимни комплекси и енергия, която се предоставя от макроергичните връзки на АТФ. АТФ е универсалният енергиен акумулатор в живите клетки. Част от ензимните реакции, свързани с използването на енергията на макроергичните връзки на АТФ, водят до хидролиза на фосфоанхидритната връзка, поради която ензимите, катализиращи реакцията, притежават АТФ хидролазна активност. Такива са например Na+, K+ – АТФаза, Ca++ – АТФаза на саркоплазматичния ретикулум, АТФазата на молекулата на миозина и др. АТФазна активност проявяват АТФсинтетазните комплекси на енергопреработващите биологични мембрани, АТФсинтетазния комплекс на плазматичната мембрана на някои прокариоти. В този случай хидролизата на АТФ от АТФсинтетазните комплекси, изолирани фактори F1 се разглежда като пълно или частично обръщане на реакцията на фосфорилиране на АДФ.
В мускулната клетка биохимията на процеса съкращение се осъществява най-общо по следната схема: АТФ + М → М – АДФ.Ф – М – АДФ.Ф + А → (А – М – АДФ.Ф) → А – М + АДФ + Ф
При наличие на АТФ: АТФ + М – А → А + М – АТФ
Методика за регистрация на АТФ Независимо от конкретния случай, регистрацията на АТФазната реакция се свежда до определянето на концентрацията на неорганичния фосфат в определен обем разтвор. Известни са различни методи за определяне регистрацията на неорганичен фосфат, но във всички случаи се използва реакция, водеща до образуване на оцветен продукт, концентрацията на който се определя чрез измерване на екстенцията.
Пробите се подготвят, като разтворите се добавят в определен ред. След внасяне на изследвания разтвор, съдържащ Ф, пробите се инкубират в продължение на 30 мин при стайна температура, след което се измерва екстинцията при дължина на вълната 750 нанометра. Концентрацията на неорганичен фосфат се определя по екситнцията на стандартната проба, или по-добре, по предварително построена стандартна крива. Стандартната крива се построява като в пробите се внася от 0,01 до 0,1 М разтвор на (от 0,01 до 0,1 М фосфат в проба).
АТФсинтетазният комплекс на митохондриите, след разпрягане на окислителното фосфорилиране (в присъствие на динитрофенол, след разрушаване на митохондриите, изолиране на субмитохондриални частици), катализира хидролизата на АТФ. Тази активност може да бъде регистрирана в среда, съдържаща 0,2 М захароза, 10 М KCI; 1 М АТФ, 1 М MgCI, 50 M трис-HCI (pH 7,5). Ако обемът на добавките в реакционната среда е голям и надвишава 1 – 2 %, реакционната среда се приготвя по-концентрирана, така че след внасяне на добавките с известно количество вода крайната концентрация на разтвора да съответства на изчисленията.
Към 4,9 мл реакционна среда при непрекъснато разбъркване с магнитна бъркалка се прибавя 0,1 мл ензим. Едновременно с добавянето се отчита началото на реакцията със секундомер. След определен интервал от време (15 сек, 30 сек, 1 мин, 2 мин, 3 мин) от реакционната среда с помощта на автоматична пипета (тип Епендорф) се взима 0,75 мл разтвор, който се пренася в предварително приготвени пластмасови епруветки, поставени в лед, всяка от които съдържа 0,15 мл 3 М HCIO
Продукция от АМФ и АДФ Продукция, аеробни условия Типичната вътреклетъчна концентрация на АТФ е трудно да се определи, но докладите показват, че има различни от 1 – 10 μМ на грам тъкан в различни еукариоти. Дефосфорилирането на АТФ и рефосфорилирането на АДФ и АМФ се появяват многократно в хода на аеробния метаболизъм.
ATP може да бъде продуциран чрез редица различни клетъчни процеси; трите основни пътя в еукариотите са (1) гликолиза, (2) Цикъл на лимонена киселина / окислително фосфорилиране и (3) бета-окисление. Общият процес на окисляване на глюкозата до въглероден диоксид, комбинацията от пътища 1 и 2, известен като аеробна гликолиза, произвежда около 30 (32) еквивалента АТФ от всяка молекула глюкоза. Друг процес, в който се синтезира АТФ от АДФ и Ф, е гликолизата. Самият процес протича с участие на ензими – кинази (фосфофруктокиназа). АТФазна активност имат и ензими, които участват в процесите на окислително фосфорилиране в дихателните – електрон пренасящи вериги при хлоропласти и митохондрии. Процесът може да се изрази по следния начин: фосфорилиране на АДФ + Ф до АТФ в светлинната фаза на фотосинтезата при пренасянето на електрон от пластхинони на цитохроми. Отделената енергия се акумулира в АТФ; фосфорилиране на АДФ + Ф до АТФ в гликолитичния път на две места; 1,3 фосфоглицерат → 3 фосфоглицерат. В този процес участва ензимът глицератфософкиназа и при превръщането на фосфоенолпирувата в пируват участва ензима пируваткиназа.
Производството на АТФ от не-фотосинтезиращ аеробен еукариот се осъществява главно в митохондриите, които съставляват близо 25% от обема на типичната клетка.
С подобни фосфокинази се синтезира АТФ и при други процеси в живите организми като отделни фермантации. Емблематичен процес в биохимизма на живите аеробни еукариоти е окислителното фосфорилиране в митохондриите или по-точно върху вътрешната мембрана. Субстрати на биохимичната реакция са: НАДH.Н, ФАД.Н2 – крайни продукти от цикъла на Кребс, О2 и с участието на сложна верига от ензими. Хидролизата на АТФ се описва от уравнението: ензим АТФ + Н2О → АДФ + Ф + Н+
В зависимост от възможностите и конкретната поставена задача АТФазната активност може да бъде регистрирана чрез определяне на концентрацията на един от продуктите – АДФ, неорганичен фосфат или Н+. Методически най-лесно и може би по този начин най-често, АТФазната активност се регистрира чрез определяна нарастването на концентрацията на неорганичния фосфат в хода на реакцията.
В гликолизата глюкозата и глицеролът се метаболизират до пируват. Гликолизата генерира два еквивалента/М АТФ чрез субстратно фосфорилиране, катализирано от два ензима, (1,3-бис)фосфоглицерат киназа (ФГК) и пируват киназа. Произвеждат се също два еквивалента/М на НАДН.Н, които могат да бъдат окислени чрез електрон-транспортната верига и да генерират допълнителен АТФ от ATP синтаза. Пируватът, генериран като краен продукт на гликолиза, е субстрат на Цикъла на Кребс (Цикъла на Лимонена Киселина, Цикъл на Трикарбоксиловите Киселини).
Гликолизата се разглежда като състояща се от две фази с по пет стъпки всяка. Фаза 1, „подготвителната фаза“, глюкозата се превръща в 2 d-глицералдехид -3-фосфат (Г3Ф). Един АТФ се използва в Реакция 1, а друг АТФ се използва в Реакция 3. Реакции 1 и 3 от гликолиза се наричат „Активираща фаза“ („Подготвителна фаза“). Във фаза 2 два еквивалента/М на Г3Ф се превръщат в два М пируват. В реакция 7 се произвеждат две молекули АТФ. В допълнение, реакция 10 се получават още две молекули АТФ. В реакции 7 и 10 АТФ се генерира от АДФ. В гликолизата (в тесен смисъл на терминът, до пируват) се образуват общо две молекули АТФ. Пътят на гликолизата се свързва с Цикъла на Лимонена Киселина впоследствие/ при аеробни условия, който произвежда допълнителни еквиваленти/М АТФ (20 – 10 за всяка молекула пируват по Hinkle).
Регулация В гликолизата хексокиназата директно се инхибира от своя продукт, глюкозо-6-фосфат, а пируват киназата се инхибира от самия Аланин, цАМФ (глюкагон). Ключовата реакция на гликолитичния път е фосфофруктокиназата (ФФК), която алостерично се инхибира от високи концентрации на АТФ, цитрат, цАМФ (цикличен АМФ) (глюкагон) и се активира от високи концентрации на фруктозо-2,6-бисфосфат (продукт на ФФК2), АМФ, фруктозо-6-фосфат и Фн. Инхибирането на ФФК от АТФ е необичайно, тъй като АТФ също е субстрат в реакцията, катализирана от ФФК; активната форма на ензима е тетрамер, който съществува в две конформации, само една от които свързва втория субстрат фруктоза-6-фосфат (Ф6Ф). Протеинът има две свързващи места за АТФ – активният център е достъпен и при двете конформации R- и T-, но свързването на АТФ към алостеричният (инхибиторен) център стабилизира Т-конформацията, която свързва слабо Ф6Ф. При ниски конценрации на АТФ гликолизата се усилва и се синтезира АТФ. Редица други малки молекули могат да компенсират индуцираното от АТФ изместване на конформацията и да реактивират отново ФФК, включително цикличен АМФ, амониеви йони, неорганичен фосфат и фруктозо-1,6- и -2,6-бифосфат.
Цикъл на Кребс Основна статия: Цитратен Цикъл и Окислително фосфорилиране