RNK-inducirani kompleks utišavanja ili RISC je multiproteinski kompleks, konkretno ribonukleoprotein, koji funkcionira u utišavanju gena putem različitih putevsa na transkripcijskom i translacijskom nivou. Koristeći jednolančane fragmente RNK (ssRNK), kao što je mikroRNK (miRNK), ili dvolančane male interferirajuće RNK (siRNA), kompleks funkcionira kao ključni alat u regulaciji djelovanja gena. Jednolančana sekvenca RNK djeluje kao predložak za RISC da prepozna komplementarnu transkript iRNK (iRNK). Kada je pronađen, jedan od proteina u RISC-u, argonaut, aktivira i cijepa iRNK. Ovaj proces naziva se interferencijska RNK (RNKi) i nalazi se u mnogih eukariota; to je ključni proces u odbrani od virusne infekcije, jer ga pokreće prisustvo dvolančane RNK (dsRNK).
Otkriće Biohemijska identifikacija RISC-a obavili su Gregory Hannon i njegove kolege iz Laboratorije Cold Spring Harbor. Bilo je to samo nekoliko godina nakon što su Andrew Fire i Craig Mello, 2006. godine podijelili Nobelovu nagrada za fiziologiju ili medicinu, za otkriće interferencije RNK.
200px|thumb|Drosophila melanogaster
Hannon i njegove kolege pokušali su identificirati mehanizme RNKi koji su uključeni u utišavanje gena, pomoću dsRNK, u ćelijama Drosophila . Drozofilske S2 ćelije su transficirane lacZ ekspresije vektora za kvantifikaciju ekspresije gena sa β-galaktozidaznom aktivnošću. Njihovi rezultati pokazali su ko-transfekciju s lacZ dsRNK, sa značajno smanjenom aktivnošću β-galaktozidaze, u odnosu na kontrolnu dsRNK. Stoga dsRNK kontroliraju ekspresiju gena putem sekvence komplementarnosti.
S2 ćelije su zatim transficirane sa Drosophila ciklin E dsRNK. Ciklin E je bitan gen za napredovanje ćelijskog ciklusa u S-fazu. Ciklin E dsRNK zaustavio je ćelijski ciklus u G1 fazi (prije S faze). Prema tome, RNKi može ciljati endogena gene.
Pored toga, ciklin E dsRNK samo je smanjio ciklinu E RNK-sličan rezultat, koji je je također prikazan upotrebom dsRNK, koja odgovara ciklinu A koji deluje u S, G2 i M fazi ćelijskog ciklusa. To pokazuje karakteristično obilježje RNKi: smanjeni nivi iRNK odgovaraju nivoima dodane dsRNK
Da bi se isprobalo da li je njihovo opažanje smanjenih nivoa mRNK posljeedica direktnog ciljanja mRNK (kao što sugeriraju podaci iz drugih sistema), S2 ćelije Drosophila transficirane su ili dsRNK Drosophila ciklinom E ili lacZ dsRNK, a zatim se inkubiraju sa sintetskom iRNK za ciklin E ili lacZ.
Ćelije transficirane ciklinom E dsRNA pokazale su razgradnju samo u ciklin E transkriptima – lacZ transkripti bili su stabilni. Suprotno tome, ćelije transficirane sa lacZ dsRNK pokazale su razgradnju samo u lacZ transkriptima, a ne u ciklinskim E-transkriptima. Njihovi rezultati naveli su Hannona i saradnike da sugeriraju da RNKi razgrađuje ciljanu iRNK putem aktivnosti specifične za sekvencu. Nukleazi dali su naziv enzim RISC
Funkcija interferencije RNK thumb|280PX|PIWI domen protrina zvanog argonaut u kompleksu sa dvolančanom RNK
Inkorporacija siRNK/miRNK RNaza III Dicer je kritični član RISC-a koji pokreće proces interferencije RNK, proizvodnjom dvolančane siRNK ili jednolančane miRNK. Enzimsko cijepanje dsRNK unutar ćelije stvara kratke fragmente siRNK dužine 21-23 nukleotida s dvonukleotidnim 3 '. Dicer na sličan način obrađuje i pre-miRNK, koja formira strukturu ukosnice, oponašajući dsRNK. Fragmenti DsRNK učitavaju se u RISC, pri čemu svaki lanac ima drugačiju sudbinu, na osnovu fenomena pravila asimetrije, izborom jednog lanca kao vodećeg u odnosu na drugi, na osnovu termodinamičke stabilnosti. Novo generirana miRNK ili siRNA djeluju kao jednolančane sekvence vodiča za RISC da ciljaju iRNK za razgradnju.
thumb|Dio interferencijskog puta RNK s različitim načinima na koje RISC može utišati gene putem njihove iRNK
RISC-vezani proteini Kompletna struktura RISC-a još uvijek nije riješena. Mnoga istraživanja su izvijestila o velikom broju veličina i komponenata RISC-a, ali nije potpuno sigurno je li to zbog mnogobrojnostu kompleksa ili zbog različitih izvora koje koriste različite studije.
+Tabela 1: Kompleksi uključeni u sklop i funkciju RISC+Prema tabeli iz Sontheimer (2005) Kompleks Izvor Poznate/očigledne komponente Procjena veličine Vidljivaa funkcija u RNKi putu Dcr2-R2D2 S2 ćelije D. melanogaster Dcr2, R2D2 ~250 kDaPrerada dsRNK, veznje siRNK RLC (A) Embrioni D. melanogaster Dcr2, R2D2 NR Prerada dsRNK, vezanje siRNK, prekursor RISC-a Holo-RISC Embrioni D. melanogasterVig]] ~ 80S Vezivanje i cijepanje ciljane RNK RISC S2 ćelije D. melanogaster Ago2, Fmr1/Fxr, Tsn, Vig ~500 kDa Vezivanje i cijepanje ciljane RNK RISC S2 ćelije D. melanogaster Ago2 ~140 kDa Vezivanje i cijepanje ciljane RNK Fmr1-asocirani kompleks S2 ćelije D. melanogaster L5, L11, 5S rRNA, Fmr1/Fxr, Ago2, Dmp68 NR Moguće vezivanje i cijepanje ciljane RNK Minimalni RISC< Ćelije HeLa eIF2C1 (Ago1) or eIF2C2 (Ago2) ~160 kDa Vezivanje i cepanje ciljane RNK miRNP Ćelije HeLa eIF2C2 (ago2), Gemin3, Gemin4 ~550 kDa Pridruživanje miRNK, vezivanje i cijepanje ciljane RNK Ago, Argonaut; Dcr, Dicer; Dmp68, D. melanogaster ortolog p68 R68 unvindaza RNK; eIF2C1, faktor inicijacije eukariotske translacije 2C1; eIF2C2, faktor inicijacije eukariotske translacije 2C2; Fmr1 / Fxr, D. melanogaster ortolog fragilnog-X proteina mentalne invalidnosti; miRNP, miRNK-proteinski kompleks; NR, nije prijavljeno; Tsn, Tudor-stafilokokna nukleaza; Vig, vas intronski gen.
thumb| Argonautni protein pune dužine iz arhejske vrste Pyrococcus furiosus
Bez obzira na to, očito je da su argonautni proteini prisutni i bitni su za funkciju. Nadalje, postoje uvidi u neke od ključnih proteina (uz argonaute) unutar kompleksa, koji omogućavaju RISC-u da obavlja svoju funkciju.
Argonautni proteini
Argonaut proteini su porodica proteina koja se nalazi i i kod prokariota i eukariota. Njihova funkcija u prokariotima je nepoznata, ali u eukarionima su odgovorni za RNKi. Osam je članova porodice u ljudskim argonautima, od kojih je samo argonaut 2 isključivo uključen u ciljano cijepanje RNK u RISC.
thumb|Kompleks za učitavanje RISC omogućava učitavanje fragmenata dsRNA (generiranih putem Dicer-a) na Argonautu 2 (uz pomoć TRBP-a) kao dio interferencijskog puta RNK.
RISC-učitavajući kompleks RISC-učitavajući kompleks (RLC) je bitna struktura, potrebna za učitavanje fragmenata dsRNK u RISC, kako bi se ciljala iRNK. RLC se sastoji od ledila, proteina koji veže RNK-vezujuću transaktivaciju (TRBP) i Argonauta 2.
Dicer je RNaza III, endonukleaza koja generira fragmente dsRNK za učitavanje koji usmjeravaju RNKi. TRBP je protein sa tri dvolančana RNK-vezujuća domena. Argonaut 2 je RNaza i katalitski je centar RISC-a.Dicer se pridružuje s TRBP i argonautom 2, kako bi olakšao prijenos fragmenata dsRNK, koje je generirao Dicer u Argonautu 2.
Novija istraživanja pokazala su da bi ljudska RNK-helikaza A mogla pomoći u olakšavanju RLC.
Ostali proteini Nedavno identificirani članovi RISC-a su SND1 i MTDH. SND1 i MTDH su onkogeni i regulišu različite ekspresije gena.
+Tabela 2: Biohemijski dokumentovani proteini povezani sa RISC+Na bazi tabele po Sontheimeru (2005) Protein Vrsta i nađeni protein Dcr1 D. melanogaster Dcr2 D. melanogaster R2D2 D. melanogaster Ago2 D. melanogaster Dmp68 D. melanogaster Fmr1/Fxr D. melanogaster Tsn D. melanogaster Vig D. melanogaster Poliribosomi, ribosomske komponente D. melanogaster, T. brucei eIF2C1 (Ago1) H. sapiens eIF2C2 (Ago2) H. sapiens Gemin3 H. sapiens Gemin4 H. sapiens
Ago, Argonaute; Dcr, Dicer; Dmp68, D. melanogaster ortolog p68 R68 unwindase RNK; eIF2C1, faktor inicijacije eukariotske translacije 2C1; eIF2C2, faktor inicijacije eukariotske translacije 2C2; Fmr1/Fxr, D. melanogaster ortolog krhkog-X proteina mentalne retardacije; Tsn, Tudor-stafilokokna nukleaza; Vig, vas intronski gen.
Vezanje iRNK thumb|350px|Dijagram aktivnosti RISC-a sa miRNK Još uvijek nije jasno kako aktivirani RISC kompleks locira ciljne iRNK u ćeliji, iako je pokazano da se proces može dogoditi u situacijama izvan trajne translacije proteina iz iRNK.
Endogeno eksprimirana miRNK u metazoa obično nije savršeno komplementarna velikom broju gena i na taj način moduliraju ekspresiju, translacijskom represijom. Međutim, u biljkama proces ima mnogo veću specifičnost da cilja iRNK i obično se svaka miRNK veže samo za jednu iRNK. Veća specifičnost znači da je vjerovatnije da će doći do razgradnje iRNK.
Također pogledajte RNK-inducirano transkripcijsko utišavanje (RITS) RNK interferencija
Reference
Dopunska literatura
Vanjski linkovi
Kategorija:RNK Kategorija:Biološki procesi