400px|right|thumb|Insertna sekvenca U molekulskoj biologiji, insert je komad DNK koji je umetnut u veći DNK vektor tehnikom rekombinantne DNK, kao što je ligacija ili rekombinacija. Ovo omogućava da se umnožava, selektira, dalje manipulira ili eksprimira u organizmu domaćina.

Inserti mogu biti u rasponu od fizičkih nukleotid nihdodataka korištenjem sistema tehnike ili dodavanja vještačkih struktura na molekuli putem mutagenih hemikalija, kao što su etidij-bromid ili kristali.

Inserti u genomu organizma obično se javljaju prirodnim uzrocima. Ovi uzroci uključuju uslove okoline i unutarćelijske procese. Ekološki inserti kreću se od izlaganja radioaktivnom zračenju kao što su UV-zračenje, mutagene hemikalije ili DNK virusi. Unutarćelijski inserti mogu nastati putem nasljednih promjena u roditeljskim ćelijama ili greške u replikaciji DNK ili popravci DNK.

Tehnike insercije gena mogu se koristiti za karakteristične mutacije u organizmu za željenu fenotipsku ekspresiju gena. Promjena genskog inserta može se izraziti u velikom broju krajeva. Ove varijante mogu se kretati od gubitka ili dobijanja funkcije proteina do promjena u fizičkoj strukturi, tj. boji kose ili očiju. Cilj promjena u ekspresiji je usmjeren na povećanje funkcije proteina za regulaciju ili do prekida ćelijske funkcije radi prevencije bolesti. Rezultati varijacija zavise od mjesta u genomu gdje se nalazi dodatak, odnosno mutacija. Cilj je naučiti, razumjeti i eventualno predvidjeti ekspresiju genetičkog materijala u organizmima korištenjem fizičke i hemijske analize. Da bi se vidjeli rezultate genetičkih mutacija ili insercija, tehnike kao što su sekvenciranje DNK, gel elektroforeza, imunotest ili mikroskopija mogu promatrati mutacije.

Historija

Područje se značajno proširilo od objavljivanja 1973. s biohemičarima Stanleyjem N. Cohenom i Herbertom W. Boyerom, koristeći bakteriju E. coli da nauči kako izrezati fragmente, spojiti različite fragmente i umetnuti nove gene. Oblast se od tada izuzetno proširila u smislu preciznosti i tačnosti. Kompjuteri i tehnologija su tehnološki olakšali postizanje sužavanja greške i proširili razumijevanje u ovoj oblasti. Kompjuteri sa visokim kapacitetom za podatke i proračune koji su učinili opipljivom obradu velike količine informacija, tj. korišćenje ChIP i genske sekvence.

Tehnike i protokoli

Homologno usmjereni popravak (HDR) je tehnika koja popravlja lomove ili lezije u molekulima DNK. Najčešća tehnika za dodavanje insertas u željene sekvence je upotreba homologne rekombinacije. Ova tehnika ima specifične zahtjeve gdje se insert može dodati tek nakon što je uveden u ćelijsko jedro, koji se može dodati genomu uglavnom tokom G2 i S faza u ćelijskom ciklusu.

Editiranje gena CRISPR Editiranje gena CRISPR zasnovano na grupisanim, redovno raspoređenim kratkim palindromskim ponavljanjima (CRISPR) -Cas9 je enzim koji koristi sekvence gena za pomoć u kontroli, cijepanju i odvajanju specifičnih sekvenci DNK koje su komplementarne CRISPR sekvenci. Ove sekvence i enzimi su izvorno izvedeni iz bakteriofaga. Važnost ove tehnike u polju genetičkog inženjerstva je u tome što daje mogućnost visoko preciznog ciljanog editiranja gena, a faktor troškova za ovu tehniku je nizak u poređenju s drugim alatima. Sposobnost insercije sekvenci DNK u organizam je lahka i brza, iako može naići na probleme ekspresije u višim složenim organizmima.

Efektorska nukleaza slična aktivatoru transkripcije

Efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije, TALEN-i, su skup restrikcijskih enzima koji se kreiraju za izrezivanje željenih sekvenci DNK. Ovi enzimi se uglavnom koriste u kombinaciji sa CRISPR-CAS9, nukleazom cinkovog prsta ili HDR-om. Glavni razlog za to je sposobnost ovih enzima da imaju preciznost da isijeku i odvoje željenu sekvencu unutar gena.

Nukleaza cinkovog prsta

Nukleaze cinkovog prsta su genetički modifikovani enzimi koji kombinuju spajanje DNK-vezujućeg domena cinkovog prsta na domen cijepanja DNK. Oni se takođe kombinuju sa CRISPR-CAS9 ili TALEN-ovima kako bi se dobio dodatak ili delecija specifičns za sekvencu unutar genoma složenijih ćelija i organizama.

Genski pištolj

Genski pištolj, također poznat kao sistem za isporuku biolističkih čestica koristi se za isporuku transgena, proteina ili RNK u ćeliju. Koristi sistem za isporuku mikroprojektila koji velikom brzinom ispaljuje obložene čestice tipskog teškog metala koji ima DNK od interesa u ćelije. Genetički materijal će prodrijeti u ćeliju i isporučiti sadržaj preko prostora. Upotreba sistema za isporuku mikroprojektila je tehnika poznata kao biolistik.

Reference

Kategorija:Molekularna biologija Kategorija:Genetičke tehnike