Zeleni fluorescentni protein

Zeleni fluorescentni protein (GFP) je protein koji pokazuje jarko zelenu fluorescenciju kada je izložen svjetlu u plavom do ultraljubičastom opsegu. Oznaka GFP tradicionalno se odnosi na protein koji je prvi izolovan iz meduza Aequorea victoria i ponekad se naziva avGFP. Međutim, GFP-ovi su pronađeni u drugim organizmima uključujući korale, morske anemone, zoanitide, copepoda i lancelete.

GFP iz A. victoria ima glavni pik ekscitacije na talasnoj dužini od 395 nm i manji na 475 nm. Vrh njegove emisije je na 509 nm, što je u donjem zelenom dijelu vidljivog spektra. Kvantni prinos (QY) florescencije GFP-a je 0,79. GFP iz morske maćuhice (Renilla reniformis) ima jedan glavni ekscitacioni vrh na 498 nm. GFP je odličan alat u mnogim oblicima biologije zbog svoje sposobnosti da formira unutrašnji hromofor, bez potrebe za bilo kakvim dodatkom kofaktora, genskih proizvoda ili enzima / supstrata osim molekulskog kisika.

U citologiji i molekulskoj biologiji, GFP gen se često koristi kao izvještač ekspresije. Korišten je u modifikovanim oblicima za pravljenje biosenzora, a stvorene su mnoge životinje koje eksprimiraju GFP, što pokazuje dokaz koncepta da se gen može eksprimirati u datom organizmu, u odabranim organima , ili u ćelijama od interesa. GFP se može uvesti u životinje ili druge vrste putem transgenih tehnika, i održavati u njihovom genomu i genomu njihovog potomstva. Do danas, GFP je bio izražen u mnogim taksonima, uključujući bakterije, kvasce, gljive, ribe i sisare, uključujući i ljudske ćelije. Naučnici Roger Y. Tsien, Osamu Shimomura i Martin Chalfie su 10. oktobra 2008. dobili Nobelovu nagradu za hemiju 2008. za njihovo otkriće i razvoj zelenog fluorescentnog proteina .

Većina komercijalno dostupnih gena za GFP i slične fluorescentne proteine dugi su oko 730 parova baza. Prirodni protein ima 238 aminokiselina. Njegova molekulska masa je 27 kD. Stoga, spajanje GFP gena sa genom proteina od interesa može značajno povećati veličinu i molekulsku masu proteina i može narušiti prirodnu funkciju proteina ili promijeniti njegovu lokaciju ili putanju transporta unutar ćelija.

Pozadina thumb|200px|Aequorea victoria thumb|3D rekonstrukcija konfokusne slike nervnih progenitora sa prekomjernom ekspresijom VEGF-a (crveno) i GFP-pozitivnih kontrolnih nervnih progenitorskih ćelija (zeleno) u olfaktornom režnju pacova. RECA-1-pozitivni krvni sudovi - plave boje.

GFP divljeg tipa (wtGFP) Prva prijavljena kristalna struktura GFP-a bila je ona mutanta S65T od strane Remingtonove grupe u Science 1996. Mjesec dana kasnije, Phillipsova grupa je nezavisno prijavila GFP divljeg tipa struktura u Nature Biotechnology. Ove kristalne strukture pružile su vitalnu pozadinu za formiranje hromofora i interakcije susjednih ostataka. Istraživači su modificirali ove ostatke usmjerenom i nasumičnom mutagenezom, kako bi proizveli širok spektar GFP derivata koji se danas koriste. Dalja istraživanja GFP-a su pokazala da je otporan je na deterdžente, proteaze, tretmane gvanidinij-hloridom (GdmCl) i drastične promene temperature.

Nomenklatura Nomenklatura modificiranih GFP-ova često je zbunjujuća zbog preklapanja mapiranja nekoliko GFP verzija na jedno ime. Naprimjer, mGFP se često odnosi na GFP sa N-terminalom palmitoilacijom koji uzrokuje da se GFP veže za ćelijske membrane. Međutim, isti termin se također koristi za označavanje monomernih GFP-a, koji se često postiže tako što interfejs dimera razbija mutaciju A206K. GFP divljeg tipa ima slabu tendenciju dimeraizacije pri koncentracijama iznad 5 mg/mL. mGFP je također skraćenica za "modificirani GFP", koji je optimiziran kroz razmjenu aminokiselina za stabilnu ekspresiju u biljnim ćelijama.

U prirodi 280px|right| Živa lanceta (B. floridae) pod fluorescentnim mikroskopom.|thumb 280px|thumb|left|Zelena fluorescencija u morskom kopepodu Pontella mimocerami

Svrha i (primarnih) bioluminiscencija (od djelovanja ekvorins na luciferin) i (sekundarne) fluorescencije GFP-a u meduzama je nepoznata. GFP se ko-eksprimira sa ekvorinom u malim granulama oko oboda zvona meduze. Sekundarni ekscitacijski vrh (480 nm) GFP-a apsorbuje nešto od plave emisije ekvorina, dajući bioluminiscenciji zeleniju nijansu. Ostatak serina 65 GFP-a hromofora je odgovoran za spektre ekscitacije sa dvostrukim vrhom GFP-a divljeg tipa. Sačuvan je u sve tri GFP izoforme koje je prvobitno klonirao Prasher. Gotovo sve mutacije ovog ostatka konsolidiraju ekscitacijske spektre u jedan vrh na 395 nm ili 480 nm. Precizan mehanizam ove osjetljivosti je složen, ali, čini se, uključuje doniranje vodika iz serina 65 u glutamat 222, koji utiče na ionizaciju hromofora. Budući da jedna mutacija može dramatično povećati 480  nm ekscitacioni vrh, što GFP čini mnogo efikasnijim partnerom ekvorina, Čini se da A. victoria evolucijski preferira manje efikasan spektar ekscitacije sa dvostrukim vrhom. Roger Tsien je spekulisao da promjenjivi hidrostatski pritisak sa dubinom može uticati na sposobnost serina 65 da donira vodik hromoforu i pomjeri omjer dva ekscitirajuća pika. Dakle, meduza može promijeniti boju svoje bioluminiscencije s dubinom. Međutim, kolaps u populaciji meduza u Friday Harbor, Washington, gdje je GFP prvobitno otkriven, omeo je dalje proučavanje uloge GFP-a u prirodnom okruženju meduze.

Poznato je da većina vrsta lancelet proizvodi GFP u različitim dijelovima svog tijela. Za razliku od A. victoria, lancete ne proizvode sopstvenu plavu svjetlost, a porijeklo njihovog endogenog GFP-a je još uvijek nepoznato. Neki nagađaju da privlači plankton prema ušću lancete, služeći kao pasivni mehanizam za lov. Takođe može poslužiti kao fotoprotektivni agens u larvama, sprečavajući oštećenja uzrokovana plavim svjetlom visokog intenziteta pretvarajući ga u zeleno svjetlo nižeg intenziteta. Međutim, ove teorije nisu testirane.

Proteini slični GFP-u pronađeni su u više vrsta morskih Copepoda, posebno iz porodica Pontellidae i Aetideidae. GFP izolovan iz Pontella mimocerami pokazao je visok nivo sjaja sa kvantnim prinosom od 0,92, što ih čini skoro dvostruko svetlijim od obično korišćenog EGFP izolovanog iz A. victoria.

Struktura GFP ima beta-barelnu strukturu koja se sastoji od jedanaest β-lanaca sa nabranim rasporedom beta-listova, sa alfa-heliksom koji sadrži kovalentno vezan hromofor 4-(p-hidroksibenziliden)imidazolidin-5- jedan (HBI) koji prolazi kroz centar. Pet kraćih alfa-heliksa formiraju kape na krajevima strukture. Beta-barelna struktura je skoro savršen cilindar, 42Å dug i 24Å u prečniku (neke studije su prijavile prečnik od 30Å), stvarajući ono što se naziva "β-kan" formacija, koja je jedinstvena za porodicu sličnih GFP-u. HBI, spontano modifikovani oblik tripeptida Ser65–Tyr66–Gly67, nije fluorescentan u odsustvo pravilno presavijene GFP skele i postoji uglavnom u neionizovanom obliku fenola u wtGFP. Bočni lanci cijevi okrenuti prema unutra indukuju specifične reakcije ciklizacije u Ser65–Tyr66–Gly67 koje indukuju ionizaciju HBI u fenolatnu formu i formiranje hromofora. Ovaj proces posttranslacijske modifikacije naziva se sazrevanjem. Mreža vodikove veze i interakcije slaganja elektrona sa ovim bočnim lancima utiču na boju, intenzitet i fotostabilnost GFP-a i njegovih brojnih derivata. Čvrsto zbijena priroda barela isključuje molekule rastvarača, štiteći hromoforsku fluorescenciju od gašenja vodom. Pored autociklizacije Ser65-Tyr66-Gly67, reakcija 1,2-dehidrogenacije se dešava na ostatku Tyr66. Pored tri ostatka koja formiraju hromofor, ostaci kao što je Gln94 , Arg96, His148, Thr203 i Glu222 djeluju kao stabilizatori. Ostaci Gln94, Arg96 i His148 su u stanju da se stabilizuju delokalizacijom naboja hromofora. Arg96 je najvažniji stabilizirajući ostatak zbog činjenice da potiče potrebna strukturna preusmjeravanja koja su neophodna iz HBI prstena. Svaka mutacija na ostatku Arg96 bi rezultirala smanjenjem brzine razvoja hromofora jer bi se izgubile pravilne elektrostatske i sterne interakcije. Tyr66 je primatelj vodikovih veza i ne ionizira kako bi proizveo povoljnu elektrostatiku. thumb|377x377px| GFP film koji prikazuje cijelu strukturu i zumirajte do fluorescentnog hromofora. thumb|300px|Molekule GFP u stilu crtanog filma, jedan u lpotpunosti, a jedan sa odsječenom stranom beta-barela, kako bi se otkrio hromofor (istaknut kao model lopte i štapa). Prma 1GFL.thumb|200px| Trakasti dijagramGFP prema 1EMA.

Autocatalitsko formiranje hromofora u wtGFP

Mehanički, proces uključuje ciklizaciju posredovanu bazom praćenu dehidratacijom i oksidacijom. U reakciji od 7a do 8 dolazi do stvaranja enamina iz imina, dok se u reakciji od 7b do 9 apstrahuje proton. Formirani HBI fluorofor je označen zelenom bojom.

Reakcije su katalizirane ostacima Glu222 i Arg96. Analogni mehanizam je također moguć sa treoninom umjesto Ser65.

Transgeni kućni ljubimci right|thumb|Miševi koji eksprimiraju GFP pod UV svjetlom (lijevo i desno), u poređenju sa normalnim mišem (u sredini) Alba, zeleno-fluorescentni zec, stvoren je u francuskoj laboratoriji koju je naručio Eduardo Kac koristeći GFP za potrebe umjetnosti i društvenog komentara. Američka kompanija Yorktown Technologies prodaje akvarijske zelene fluorescentne zebrice (GloFish) koje su prvobitno razvijene za otkrivanje zagađenja u vodenim putevima. NeonPets, kompanija sa sjedištem u SAD-u, reklamirala je zelene fluorescentne miševe industriji kućnih ljubimaca kao NeonMice. Zelene fluorescentne svinje, poznate kao Noels, uzgajala je grupa istraživača pod vodstvom Wu Shinn-Chiha na Odsjeku za nauku o životinjama i tehnologiju na Nacionalnom univerzitetu Tajvana.Scientists in Taiwan breed fluorescent green pigs Japansko-američki tim stvorio je zeleno-fluorescentne mačke kao dokaz koncepta kako bi ih potencijalno koristio kao uzorne organizme za bolesti, posebno HIV. U 2009. južnokorejski tim sa Nacionalnog univerziteta u Seulu uzgojio je prve transgene biglove sa ćelijama fibroblasta iz morskih anemona. Psi emituju crveno fluorescentno svjetlo, a trebali bi omogućiti naučnicima da proučavaju gene koji uzrokuju ljudske bolesti poput narkolepsija i sljepila.

Također pogledajte Proteinska oznaka pGLO Žuti fluorescentni protein Genetićki kodirani indikator napona

Reference

Dopunska literatura

Popular science book describing history and discovery of GFP

Vanjski linkovi

A comprehensive article on fluorescent proteins at Scholarpedia Brief summary of landmark GFP papers Interactive Java applet demonstrating the chemistry behind the formation of the GFP chromophore Video of 2008 Nobel Prize lecture of Roger Tsien on fluorescent proteins Excitation and emission spectra for various fluorescent proteins Green Fluorescent Protein Chem Soc Rev themed issue dedicated to the 2008 Nobel Prize winners in Chemistry, Professors Osamu Shimomura, Martin Chalfie and Roger Y. Tsien Molecule of the Month, June 2003: an illustrated overview of GFP by David Goodsell. Molecule of the Month, June 2014: an illustrated overview of GFP-like variants by David Goodsell. Green Fluorescent Protein on FPbase, a fluorescent protein database

Kategorija:Proteinski metodi Kategorija:Rekombinantni proteini Kategorija:Snimanje ćelija Kategorija:Snimanje proteina * Kategorija:Bioluminiscencija Kategorija:Knidarijski proteini