U bioinformatici, analiza sekvenci je proces podvrgavanja DNK, RNK ili peptidne sekvence bilo kojoj od širokog spektra analitičkih metoda, kako bi se razumjele njene karakteristike, funkcija, struktura ili evolucija. [Može se izvesti na cijelom genomu, transkriptomu ili proteomu organizma, a može uključivati i samo odabrane segmente ili regije, poput tandemskih ponavljanja i transpozabilnih elemenata. Korištene metodologije uključuju poravnanje sekvenci, pretrage u biološkim bazama podataka i druge.

Od razvoja metoda visokopropusne proizvodnje genskih i proteinskih sekvenci, stopa dodavanja novih sekvenci u baze podataka se vrlo brzo povećala. Takva kolekcija sekvenci sama po sebi ne povećava razumijevanje biologije organizama od strane naučnika. Međutim, poređenje ovih novih sekvenci sa onima sa poznatim funkcijama je ključni način razumijevanja biologije organizma iz kojeg nova sekvenca potiče. Stoga se analiza sekvenci može koristiti za dodjeljivanje funkcije kodirajućim i nekodirajućim regijama u biološkoj sekvenci, obično poređenjem sekvenci i proučavanjem sličnosti i razlika. Danas postoji mnogo alata i tehnika koje omogućavaju poređenje sekvenci (poravnanje sekvenci) i analiziraju proizvod poravnanja kako bi se razumjela njegova biologija. Analiza sekvenci u molekularnoj biologiji uključuje vrlo širok spektar procesa:

Poređenje sekvenci radi pronalaženja sličnosti, često radi zaključivanja da li su povezane (homologne) Identifikacija intrinzičnih karakteristika sekvence kao što su aktivna mjesta, mjesta posttranslacijske modifikacije, genske strukture, otvoreni okvir čitanja, distribucije introna i egzona i regulatorni elementi Identifikacija razlika i varijacija u sekvenci kao što su tačkasta mutacija i polimorfizam jednog nukleotida (SNP) kako bi se dobio genetički marker. Otkrivanje evolucije i genetičke raznolikosti sekvenci i organizama Identifikacija molekularne strukture samo iz sekvence.

Historija

Od prve sekvence proteina insulina koje je okarakterizirao Fred Sanger 1951. godine, biolozi pokušavaju iskoristiti ovo znanje kako bi razumjeli funkciju molekula. Njegovaa otkrića i njegovih kolega doprinijela su uspješnom sekvenciranju prvog genoma zasnovanog na DNK. Metod korišten u ovoj studiji, koji se naziva "Sangerov metod" ili Sangerovo sekvenciranje, bio je prekretnica u sekvenciranju dugolančanih molekula poput DNK. Ovaj metod je na kraju korištena u Projektu ljudskog genoma. Prema Michaelu Levittu, analiza sekvenci je nastala u periodu od 1969. do 1977. U 1969. analiza sekvenci transfernih RNK korištena je za zaključivanje o interakcijama ostataka iz koreliranih promjena u nukleotidnim sekvencama, što je dovelo do modela sekundarne strukture tRNK. u 1970, Saul B. Needleman i Christian D. Wunsch objavili su prvi kompjuterski algoritam za poravnavanje dvije sekvence. Tokom ovog vremena, napredak u dobijanju nukleotidnih sekvenci se znatno poboljšao, što je dovelo do objavljivanja prvog kompletnog genoma bakteriofaga 1977. godine. Vjeruje se da su Robert Holley i njegov tim na Univerzitetu Cornell prvi koji su sekvencirali molekulu RNK.

Pregled analize nukleotidnih sekvenci (DNK i RNK)

Analize nukleotidnih sekvenci identificiraju funkcionalne elemente poput mjesta vezivanja proteina, otkrivaju genetske varijacije poput SNP-ova, proučavaju obrasce ekspresije gena i razumiju genetsku osnovu osobina. Pomaže u razumijevanju mehanizama koji doprinose procesima poput replikacije i transkripcije. Neki od uključenih zadataka navedeni su u nastavku.

Kontrola kvaliteta i predobrada Kontrola kvaliteta procjenjuje kvalitet očitavanja sekvenciranja dobivenih tehnologijom sekvenciranja (npr. Illumina). To je prvi korak u analizi sekvenciranja kako bi se ograničili pogrešni zaključci zbog lošeg kvaliteta podataka. Alati koji se koriste u ovoj fazi zavise od platforme za sekvenciranje. Naprimjer, FastQC provjerava kvalitet kratkih očitavanja (uključujući RNK sekvence), Nanoplot ili PycoQC se koriste za dugačke sekvence (npr. očitavanja Nanopore sekvenci), a MultiQC agregira rezultat FastQC-a u formatu web stranice. Kontrola kvaliteta pruža informacije kao što su dužine očitavanja, GC sadržaja, prisustvo adapterskih sekvenci (za kratka očitavanja) i rezultat kvaliteta, koji se često izražava na PHRED skali. Ako su u očitanjima prisutni adapteri ili drugi artefakti iz PCR amplifikacije (posebno kratka očitavanja), oni se uklanjaju pomoću softvera kao što je Trimmomatic. ili Cutadapt.

Poravnanje očitanih podataka

U ovom koraku, sekvencirani podaci čiji je kvalitet poboljšan mapiraju se na referentni genom korištenjem alata za poravnanje poput BWA za čitanje kratkih DNK sekvenci, minimapa za dugočitane DNK sekvence i STAR za očitavanja RNK sekvenci. Svrha mapiranja je pronaći porijeklo bilo kojeg datog očitavanja na osnovu referentne sekvence. Također je važno za otkrivanje varijacija ili filogenetske studije. Izlaz iz ovog koraka, odnosno poravnata očitavanja, pohranjuju se u kompatibilnim formatima datoteka poznatim kao SAM, koji sadrže informacije o referentnom genomu kao i o pojedinačnim očitavanjima. Alternativno, formati BAM datoteka su poželjniji jer koriste mnogo manje prostora na stolu ili za pohranu.

Napomena: Ovo se razlikuje od poravnavanja sekvenci koje poredi dvije ili više cijelih sekvenci (ili regija sekvenci) kako bi se kvantificirala sličnost ili razlike ili identificirala nepoznata sekvenca (kao što je objašnjeno u nastavku).

Sljedeći koraci analize su specifični za DNK sekvence:

Pozivanje varijanti

Identifikacija varijanti je popularan aspekt analize sekvenci jer varijante često sadrže informacije od biološkog značaja, kao što je objašnjenje mehanizma otpornosti na lijekove kod zarazne bolesti. Ove varijante mogu biti varijante jednog nukleotida (SNV), male insercije/delecije (indeli) i velike strukturne varijante. Poravnanja očitavanja se sortiraju pomoću SAMtools, nakon čega se koriste pozivači varijanti kao što je GATK se koriste za identifikaciju razlika u poređenju sa referentnom sekvencom.

Izbor alata za pozivanje varijanti uveliko zavisi od korištene tehnologije sekvenciranja, tako da se GATK često koristi pri radu sa kratkim sekvencama, dok duge sekvence zahtijevaju alate poput DeepVariant-a. i Sniffles-a. Alati se također mogu razlikovati na osnovu organizma (prokarioti ili eukarioti), izvora podataka o sekvenci (rak vs. metagenomika) i tipa varijante od interesa (SNV-ovi ili strukturne varijante). Izlaz pozivanja varijanti je obično u formatu vcf i može se filtrirati korištenjem frekvencija alela, ocjena kvalitete ili drugih faktora na osnovu datog istraživačkog pitanja.

Označavanje varijanti Ovaj korak dodaje kontekst podacima o varijanti koristeći odabrane informacije iz recenziranih radova i javno dostupnih baza podataka poput gnomAD i Ensembl. Varijante se mogu anotirati informacijama o genomskim karakteristikama, funkcionalnim posljedicama, regulatornim elementima i frekvencijama populacije pomoću alata poput ANNOVAR-a ili SnpEff-a., ili prilagođene skripte i cjevovod. Izlaz ovog koraka je datoteka s anotacijama u bed ili txt formatu.

Vizualizacija i interpretacija

Genomski podaci, kao što su poravnanja očitavanja, dijagrami pokrivenosti i pozivi varijanti, mogu se vizualizirati korištenjem preglednika genoma kao što su IGV (Integrative Genomics Viewer) ili UCSC Preglednika genoma. Interpretacija rezultata se vrši u kontekstu biološkog pitanja ili hipoteze koja se istražuje. Izlaz može biti grafički prikaz podataka u obliku Circos dijagrama, vulkanskih dijagrama itd. ili drugih oblika izvještaja koji opisuju zapažanja.

Analiza DNK sekvenci može također uključivati statističko modeliranje za zaključivanje o odnosima i epigenetičku analizu, poput identificiranja diferencijalnih metilacijskih regija pomoću alata kao što je DSS.

Sljedeći koraci su specifični za RNK sekvence:

Analiza ekspresija gena

Mapirane RNK sekvence se analiziraju kako bi se procijenili nivoi ekspresije gena pomoću alata za kvantifikaciju kao što je HTSeq, i identificirati različito eksprimirane gene (DEG) između eksperimentalnih uvjeta koristeći statističke metode poput DESeq2. Ovo se provodi kako bi se uporedili nivoi ekspresije gena ili izoformi između ili preko različitih uzoraka i zaključila biološka relevantnost. Izlaz analize ekspresije gena je obično tabela sa vrijednostima koje predstavljaju nivoe ekspresije ID-ova ili imena gena u redovima i uzorcima u kolonama, kao i standardne greške i p-vrijednosti. Rezultati u tabeli mogu se dalje vizualizirati korištenjem vulkanskih dijagrama i toplotnih mapa, gdje boje predstavljaju procijenjeni nivo ekspresije. Paketi poput ggplot2 u R-u i Matplotlib u Pythonu često se koriste za kreiranje vizuala. Tabela se također može anotirati korištenjem referentne datoteke za anotaciju, obično u formatu GTF ili GFF kako bi se pružio veći kontekst o genima, kao što su naziv hromosoma, lanac i početak i pozicije, te pomoglo u interpretaciji rezultata.

Analiza funkcionalnog obogaćivanja

Analiza funkcionalnog obogaćivanja identificira biološke procese, puteve i funkcionalne utjecaje povezane s različito eksprimiranim genima dobivenim iz prethodnog koraka. Koristi alate poput GOSeq i Pathview. Ovo kreira tabelu sa informacijama o tome koji su putevi i molekularni procesi povezani sa različito eksprimiranim genima, koji su geni smanjeno ili pojačano regulirani i koji su termini genska ontologija ponavljajući ili previše zastupljeni.

Analiza RNK sekvenci istražuje dinamiku ekspresije gena i regulatorne mehanizme koji leže u osnovi bioloških procesa i bolesti. Interpretacija slika i tabela se vrši u kontekstu hipoteza koje se istražuju. Analiziranje proteinskih sekvenci

Analiza proteinske sekvence proučava kompletan skup proteina koje organizam ili ćelija eksprimira pod specifičnim uslovima. Opisuje strukturu, funkciju, posttranslacijske modifikacije i interakcije proteina unutar bioloških sistema. Često počinje sa sirovim podacima masene spektrometrije (MS) iz proteomskih eksperimenata, obično u mzML, mzXML ili RAW formatima datoteka.

Osim prethodne obrade sirovih MS podataka za uklanjanje šuma, normalizaciju intenziteta i detekciju vrhova i pretvaranja vlasničkih formata datoteka (npr. RAW) u formate otvorenog koda (mzML, mzXML) radi kompatibilnosti s alatima za analizu, drugi analitički koraci uključuju identifikaciju peptida, kvantifikaciju peptida, zaključivanje i kvantifikaciju proteina, generiranje izvještaja o kontroli kvaliteta te normalizaciju, imputaciju i testiranje značajnosti. Izbor i redoslijed analitičkih koraka zavise od korištene MS metode, koja može biti akvizicija zavisna od podataka (DDA) ili nezavisna akvizicija (DIA).

Genomski preglednici u analizi sekvenci

Genomski preglednici nude korisnički interfejs bez koda za vizualizaciju genoma i genomskih segmenata, identifikaciju genomskih karakteristika i analizu odnosa između brojnih genomskih elemenata. Tri primarna genomska preglednika – Ensembl genomski preglednik, UCSC genomski preglednik i Nacionalni centar za biotehnološke informacije (NCBI) - podržavaju različite postupke analize sekvenci, uključujući sastavljanje genoma, anotaciju genoma i komparativnu genomiku poput istraživanja diferencijalnih obrazaca ekspresije i identifikacije konzerviranih regija. Svi preglednici podržavaju više formata podataka za otpremanje i preuzimanje i pružaju veze do vanjskih alata i resursa za analizu sekvenci, što doprinosi njihovoj svestranosti.

Poravnanje sekvence

thumb|650px|center|Primjer višestrukog poravnanja sekvenci