La quimotripsina (Nombre EC 3.4.21.1,3.4.21.1 chymotrypsin, chymotrypsins A and B, alpha-chymar ophth, avazyme, chymar, chymotest, enzeon, quimar, quimotrase, alpha-chymar, alpha-chymotrypsin A, alpha-chymotrypsin) és un enzim digestiu sintetitzat per les cèl·lules acinars del pàncrees que conté un residu de serina molt reactiu. S'encarrega de la degradació de proteïnes (proteòlisi) durant la digestió, formant part del suc pancreàtic. El seu lloc d'actuació principal és el duodè, on realitza el trencament selectiu d'enllaços peptídics contigus a l'extrem carboxil d'aminoàcids hidròfobs voluminosos (tirosina, triptòfan, fenilalanina i metionina). La quimotripsina escindeix específicament els enllaços peptídics que contenen un anell aromàtic a la cadena lateral. Aquesta estructura encaixa amb una “butxaca hidròfoba” de l'enzim, denominada S1. La unió de la cadena lateral específica amb la “butxaca hidrofòbica” col·loca l'enllaç peptídic en el centre actiu de l'enzim, per procedir a la seva ruptura.
Estructura L'estructura tridimensional de la quimotripsina va ser resolta per David Blow l'any 1967. Té una estructura tridimensional semblant a una esfera i formada per tres cadenes polipeptídiques enllaçades amb ponts disulfur. Se sintetitza com un polipèptid únic, el quimotripsinogen, el qual s'activa amb la ruptura proteolítica del polipèptid per proporcionar tres cadenes. La cadena lateral de la Serina 195 forma un pont d'hidrogen amb l'anell imidazole de la Histidina 57 i el grup carboxilat de l'Àcid Aspàrtic 102 forma un pont d'hidrogen amb el grup amino d'aquest anell. Això constitueix la zona plana anomenada tríada catalítica. Aquest examen de l'estructura amb anàlegs del substrat i inhibidors enzimàtics va permetre el descobriment d'una estructura hidrofòbica amb forma de bossa en la qual poden entrar les cadenes laterals llargues i no carregades de residus com la fenilalanina i el triptòfan. La unió de la cadena lateral apropiada dins aquesta bossa permet que al centre actiu s'hi col·loqui l'enllaç peptídic adjacent per al seu trencament.
Formació i activació miniatura|Quimotripsina: formació i activació La quimotripsina es forma a conseqüència de la proteòlisi del quimotripsinogen (precursor inactiu) per la tripsina. El quimotripsinogen se sintetitza en les cèl·lules acinars del pàncrees, de la mateixa manera que altres zimògens i enzims digestius. Després de la seva síntesi, la molècula és emmagatzemada en grànuls rodejats per membrana. Aquests són acumulats a l'àpex de les cèl·lules acinars fins que tingui lloc la seva alliberació estimulada per senyals hormonals o impulsos nerviosos, moment en el qual el contingut d'aquests grànuls és alliberat al conducte que condueix fins al duodè. El quimotripsinogen està constituït per una única cadena polipeptídica de 245 residus d'aminoàcids; en aquesta forma no té gairebé activitat enzimàtica. Aquesta cadena de quimotripsinogen es convertirà en un enzim completament actiu quan la tripsina talli l'enllaç peptídic entre l'arginina 15 i la isoleucina 16. En aquest moment l'enzim resultant rep el nom de Quimotripsina π, el qual actuarà sobre altres molècules iguals, separant així dos pèptids i originant la Quimotripsina α (forma més estable de l'enzim). La quimotripsina α està formada per 3 cadenes que estan unides entre si per dos ponts disulfur intercatenaris i té una forma aproximadament esfèrica. El que val la pena remarcar en tot aquest procés d'activació, és que l'escissió d'un únic enllaç peptídic específic, converteix la proteïna des d'una forma catalíticament inactiva a una altra plenament activa. L'escissió de l'enllaç peptídic entre els aminoàcids 15 i 16 desencadena canvis en la conformació i estructura de la molècula, que afavoreixen a la formació del centre actiu que permetrà l'acoblament amb el substrat. El centre actiu es troba a la superfície de la molècula, rodejat per la serina 195 i cadenes laterals. En la seva forma inicial la quimotripsina es troba com a precursor enzimàtic inactiu (Quimotripsinogen) per evitar que l'activitat enzimàtica degradi el pàncrees.
Activitat i cinètica La quimotripsina in vivo és un enzim intestinal proteolític o de digestió del grup de les serina proteases que actua en els sistemes digestius dels mamífers i altres organismes. La família de serina proteases la constitueixen enzims que, al lloc de fixació del substrat, tenen un residu de serina activat de manera que hidrolitza catalíticament els enllaços peptídics. Molts descobriments sobre el mecanisme d'acció de la quimotripsina es basen en assajos d'inhibició i de cinètiques dels substrats mencionats, aprofitant que el trencament del substrat p-nitrofenil de N-acetil-L-fenilamina dona lloc al p-nitrofenolat, el qual té color groc i permet mesurar la seva concentració mitjançant tècniques d'absorbància a 400-410 nm. En aquestes condicions d'estat estacionari el trencament d'aquest substrat obeeix a la cinètica de Michaelis-Menten. La fase inicial s'examina utilitzant la tècnica de fluid aturat, que permet la barreja ràpida de l'enzim i el substrat i que va revelar una “fase explosiva” durant la qual es produeix ràpidament el producte de color groc. En estat estacionari es genera de nou més lentament. Es conclou que la hidròlisi té lloc en dos passos.
La quimotripsina facilita el trencament dels enllaços peptídics per reaccions hidrolítiques; un procés que, tot i ser termodinàmicament favorable, té lloc de forma extraordinàriament lenta en absència de catalitzadors. En aminoàcids hidrofòbics voluminosos trenca de manera selectiva els enllaços peptídics de l'extrem carboxil. Així, els seus principals substrats inclouen el Triptòfan, la Tirosina, Fenilamina o Metionina. Trenca els enllaços peptídics actuant sobre el grup carbonil no reactiu amb un potent nucleòfil, el residu 195 de la Serina. El residu de Serina de la quimotripsina és summament reactiu i s'uneix covalentment al substrat formant un intermediari enzim-substrat. S'ubica al centre actiu juntament amb la Histidina 57 i l'Àcid Aspàrtic 102 constituint la tríada catalítica del centre actiu. Els centres actius de les proteases de Serina tenen un conjunt característic d'aminoàcids: la tríada de proteasa de Serina. Moltes proteïnes tenen tríades catalítiques similars que es diferencien bàsicament en l'especificitat: la quimotripsina trenca l'enllaç peptídic després de residus amb cadenes llargues laterals apolars o aromàtiques. Tenint en compte el sistema de numeració, la tríada catalítica de la quimotripsina la constitueixen Asp102, Hist57 i Ser195. Mitjançant estudis amb l'enzim cristal·litzat unit a anàlegs de substrat s'ha descobert que, en el centre actiu, aquests residus són molt propers. Aquesta disposició de residus condueix a l'alta reactivitat de la Serina 195. Així, l'anell imidazole de la Histidina, situat entre el grup carboxil de l'Aspartat i el grup hidroxil de la Serina 195 es troba pròxim a la cadena lateral de Serina, i polaritza el seu grup hidroxil deixant-lo preparat per a la deprotonació. El substrat accepta el protó del grup hidroxil de la Serina 195 de manera que aquesta funciona com a catalitzador bàsic general. La retirada del protó del grup hidroxil genera un ió alcòxid que té molt més poder nucleofílic que un alcohol. L'oxigen nucleòfil de l'hidroxil de la Ser 195 llança un atac contra el carboni carbonílic del substrat i es forma un intermediari tetraèdric o estat de transició que s'uneix a l'enzim principalment per l'eficiència catalítica de les proteases de Serina. L'intermediari tetraèdric es descompon després per formar l'intermediari acil-enzim unit de manera covalent. En els últims passos s'inverteixen els dos passos previs. El residu de l'Aspartat polaritza la Histidina i permet que actuï com a base general, ja que orienta el grup imidazole convertint-lo en un millor acceptor de protons. S'hidrolitza l'intermediari acil-enzim per alliberar el component àcid carboxílic del substrat i regenerar l'enzim lliure. Es trenca l'enllaç entre l'oxigen de la Serina i el carboni carbonílic del substrat i la Serina torna a formar un enllaç hidrogen amb la His 57.
Es podria dir, per tant, que la reacció de la quimotripsina amb el seu substrat té lloc en dues etapes: una primera fase d'ignició o explosió i un estat estacionari posterior tot seguint la cinètica de Michaelis-Menten. La forma d'actuar es pot explicar com una hidròlisi que té lloc en dues fases: la formació de l'intermediari i el posterior retorn de l'enzim a l'estat original. En altres paraules, el mecanisme d'hidròlisi peptídica il·lustra els principis de la catàlisi acido-bàsica i covalent. La reacció té lloc en 8 passos: Unió del substrat Atac nucleofílic de la serina sobre el grup carbonil peptídic: L'Oxigen de la cadena lateral de la Serina 195 realitza un atac nucleofílic sobre l'àtom de carboni carbonílic de l'enllaç peptídic diana del substrat. La disposició plana de tres àtoms se substitueix ara per un tetraedre de quatre àtoms enllaçats al carboni carbonílic. És una estructura inestable amb una càrrega negativa sobre l'àtom d'oxigen derivat del grup carbonil. El grup amino d'un aminoàcid situat en el centre denominat cavitat de l'oxianió s'encarrega d'estabilitzar aquesta càrrega el temps suficient perquè es trenqui l'enllaç peptídic. Col·lapse de l'intermediari tetraèdric Alliberament del component amino. : El component amino es troba ara lliure per apartar-se de l'enzim. Unió de l'aigua: La deciclació s'inicia quan una molècula d'aigua se situa en el lloc ocupat anteriorment pel component amino del substrat. Atac nucleofílic de l'aigua sobre l'intermediari acil-coenzim: El grup èster de l'acil-enzim s'hidrolitza ara mitjançant un procés que bàsicament és la repetició dels passos 2,3, i 4. La Histidina 57 actua com un catalitzador bàsic general, separant el protó de la molècula d'aigua. L'ió hidròxid que s'obté ataca l'àtom de carboni carbonil del grup acil, formant un intermediari tetraèdric. Col·lapse de l'intermediari tetraèdric: Aquesta estructura es descompon per formar el producte àcid carboxílic. Alliberament del component àcid carboxílic: Finalment, l'alliberament del producte àcid carboxílic posa a punt l'enzim per desenvolupar un altre cicle catalític.
miniatura|Mecanisme de reacció El residu de serina del centre actiu té un paper especialment important en els mecanismes catalítics d'aquest grup d'enzims. Les proteases de serina s'inhibeixen de forma irreversible pel DPF (diisopropilfluorofosfat). En els enzims inhibits pel DPF l'inhibidor està unit de forma covalent només a la Ser 195 i no a cap altra de les 29 Serines. Aquesta reacció de modificació química va suggerir que aquest residu de serina especialment reactiu duia a terme un paper central en el mecanisme catalític de la quimotripsina. La Serina 195 no està dissociada a pH 7’4, per això, és necessari tot aquest mecanisme per ionitzar aquest grup fortament bàsic.