En biologia molecular, el clonatge o clonació molecular és un conjunt de mètodes experimentals que es fan servir per assemblar molècules d'ADN recombinant i per dirigir la seva replicació dins organismes hostes. L'ús de la paraula clonatge fa referència al fet que el mètode implica la replicació d'una molècula per produir una població de cèl·lules amb molècules d'ADN idèntic. El clonatge molecular generalment utilitza seqüències d'ADN de dos organismes diferents: l'espècie que és la font de l'ADN que ha de ser clonat, i l'espècie que servirà com l'amfitrió de per a la replicació de l'ADN recombinant. La síntesi artificial d'ADN també permet clonar seqüències sintètiques que han estat dissenyades pels investigadors. Els mètodes de clonatge molecular són centrals a moltes àrees contemporànies de la medicina i la biologia modernes.
En un experiment de clonatge molecular convencional, l'ADN que ha de ser clonat és obtingut a partir d'un organisme d'interès, llavors es tractat amb enzims en un tub d'assaig per generar fragments d'ADN més petits. Posteriorment, aquests fragments són combinats amb un vector d'ADN per generar molècules d'ADN recombinant. El qual és llavors introduït en un organisme amfitrió (típicament un que sigui una soca de laboratori, per exemple d'E. coli, i que sigui fàcil de fer créixer i també benigne). Això generarà una població d'organismes en els quals les molècules d'ADN recombinant són replicades juntament amb l'ADN amfitrió. Com que contenen fragments d'ADN estranger, aquests organismes s'anomenen transgènics o microorganismes genèticament modificats (OGM). Aquest procés aprofita el fet que un sol bacteri pot ser induït per captar i replicar una sola molècula d'ADN recombinant. Llavors aquest individu es pot reproduir de manera exponencial per generar una gran quantitat de bacteris fills, cadascun dels quals conté còpies de la molècula recombinant original. Per això, tant la població bacteriana resultat com i la molècula d'ADN recombinant s'anomenen "clons". En sentit estricte, ADN recombinant es refereix a molècules d'ADN, mentre clonatge molecular es refereix als mètodes experimentals utilitzats per unir aquestes molècules.
Història Abans de la dècada dels 70, la comprensió de la genètica i la biologia molecular estava severament limitada degut a la incapacitat d'aïllar i estudiar gens individuals d'organismes complexos. Això va canviar dramàticament amb l'adveniment de mètodes de clonatge molecular. Els microbiòlegs, amb l'objectiu d'entendre els mecanismes moleculars a través dels quals els bacteris reprimeixen el creixement dels bacteriòfags, van aïllar endonucleases de restricció, enzims que poden segmentar molècules d'ADN només quan s'uneixen a seqüències específiques d'ADN. Van demostrar que els enzims de restricció segmenten les molècules d'ADN de longitud cromosòmica en ubicacions específiques, i que cada un dels fragments específics obtinguts a partir de la molècula més gran pot ser purificat degut a les mides diferents dels fragments mitjançant fraccionament de mida. Utilitzant un segon enzim, l'ADN ligasa, els fragments generats pels enzims de restricció poden ser units formant noves combinacions, anomenades ADN recombinant. Recombinant els segments d'ADN d'interès amb un vector d'ADN, com ara bacteriòfags o plasmidis, els quals es repliquen a ells mateixos de manera natural a l'interior dels bacteris, grans quantitats de molècules d'ADN recombinant poden ser produïdes en cultius bacterians. Les primeres molècules d'ADN recombinant van ser generades i estudiades l'any 1972.
Visió de conjunt El clonatge molecular aprofita el fet que l'estructura química de l'ADN és bàsicament la mateixa en tots els éssers vius. Per tant, si qualsevol segment d'ADN de qualsevol organisme és inserit en un altre segment d'ADN que conté les seqüències moleculars requerires per la replicació de l'ADN, i l'ADN recombinant resultant és introduït en l'organisme del qual les seqüències de replicació havien estat obtingudes, llavors l'ADN estranger serà replicat juntament amb l'ADN de la cèl·lula amfitriona de l'organisme transgènic.
El clonatge molecular és semblant a la reacció de cadena de la polimerasa (PCR) en el sentit que permet la replicació d'una seqüència d'ADN específica. La diferència fonamental entre els dos mètodes és que el clonatge molecular implica la replicació de l'ADN en un ésser viu, mentre que la PCR replica l'ADN in vitro, lliure de cèl·lules.
Passos del clonatge molecular En experiments de clonatge moleculars estàndards, el clonatge de qualsevol fragment d'ADN implica essencialment set passos: L'elecció de l'organisme amfitrió i el vector de clonació, La preparació del vector d'ADN, La preparació de l'ADN que ha de ser clonat, La creació de l'ADN recombinant, La introducció de l'ADN recombinant en l'organisme amfitrió, La selecció dels organismes que contenen l'ADN recombinant, El triatge dels clons que contenen els fragments d'ADN desitjat i també les propietats biològiques desitjades.
Elecció de l'organisme amfitrió i el vector de clonatge miniatura|Mapa genètic d'un plasmidi emprat amb freqüència pel clonatge molecular; pBR322. És una peça circular d'ADN de 4.361 bases. Hi són presents dos gens que confereixen resistència als antibiòtics ampicil·lina i tetraciclina, i un origen de replicació que l'amfitrió fa servir per replicar l'ADN. Tot i que es poden fer servir un nombre molt gran d'organismes amfitrions i vectors de clonatge molecular, la gran majoria dels experiments de clonatge molecular comencen amb una soca de laboratori del bacteri E. coli i un plasmidi com a vector de clonatge. E. coli i els plasmidis es fan servir de forma habitual perquè són tècnicament sofisticats, versàtils, àmpliament disponibles, i permeten el creixement ràpid dels organismes recombinants amb un equipament mínim. Si l'ADN que ha de ser clonat és excepcionalment gran (de centenars de milers a milions de parells de bases), llavors se sol fer servir un cromosoma artificial bacterià o un cromosoma artificial de llevat.
Algunes aplicacions especialitzades poden requerir vectors amb sistemes especialitzats de l'amfitrió. Per exemple, si els experimentadors desitgen sintetitzar una proteïna particular en l'organisme recombinant, llavors es fa servir un vector d'expressió que conté els senyals apropiats per a la transcripció i la traducció en l'organisme amfitrió desitjat. Alternativament, si la replicació de l'ADN és en diverses espècies (per exemple, la transferència horitzontal de gens d'ADN de bacteris a plantes), llavors un vector d'amfitrió múltiple (també anomenat shuttle vector) pot ser seleccionat. Tanmateix, els experiments de clonatge molecular especialitzats normalment comencen clonant un plasmidi a un bacteri, i després es fa servir la tècnica del subcloning per a introduir el segment d'interès a un vector especialitzat.
Sigui quina sigui la combinació d'amfitrió i vector utilitzada, gairebé sempre el vector conté quatre segments d'ADN que són críticament importants per a la seva funció i utilitat experimental: L'origen de replicació de l'ADN necessari pel vector (i les seves respectives seqüències recombinants) per replicar-se a l'interior de l'organisme amfitrió. Un o més llocs de reconeixement d'endonucleases de restricció únics que serveixen com a llocs on l'ADN estranger pot ser introduït. Un marcador gènic de selecció que es pot fer servir per aconseguir la supervivència de les cèl·lules que han captat el vector. Un gen marcador que es pot fer servir per triar les cèl·lules que contenen l'ADN estranger.
miniatura|Segmentació d'una seqüència d'ADN que conté el lloc de restricció BamHI. L'ADN és segmentat a la seqüència palindròmica per tal de produir sticky ends
Preparació de l'ADN vector El vector de clonatge és tractat amb endonucleasa de restricció per tallar l'ADN al lloc on l'ADN estranger serà inserit. L'enzim de restricció és escollit per generar una configuració al lloc de segmentació que sigui compatible amb els finals de l'ADN estranger. Típicament, això es fa segmentant l'ADN del vector i l'ADN estranger amb el mateix enzim de restricció, per exemple EcoRI. Els vectors més moderns contenen múltiples llocs de restricció que hi són únics (de manera que el vector només pot ser segmentat a un sol lloc) i es troben a la seqüència d'un gen de manera que la seva inactivació serveix per identificar els organismes recombinants dels no-recombinants en etapes futures del procés. Per millorar la proporció d'organismes recombinants en comparació als no-recombinants, el vector segmentat pot ser tractat amb un enzim (fosfatasa alcalina) que desfosforila els finals de vector. Les molècules del vector amb els finals desfosforilats són incapaces de replicar-se, i la replicació només pot ser restaurada si l'ADN estranger és integrat al lloc de segmentació.
Preparació de l'ADN que ha de ser clonat miniatura|L'ADN que ha de ser clonat és generalment produït mitjançant PCR. L'ADN plantilla és barrejat amb nucleòtids (les unitats que conformen l'ADN), primers (peces curtes d'ADN de cadena senzilla complementàries a l'ADN plantilla) i una polimerasa d'ADN que construeix la nova cadena d'ADN. La barreja passa per cicles d'escalfament i refredament per produir grans quantitats d'ADN copiat. Per clonar d'ADN genòmic, l'ADN que ha de ser clonat és extret de l'organisme d'interès. Teòricament qualsevol font de teixit pot ser utilitzada (fins i tot teixits d'animals extints), sempre que l'ADN no hagi estat extensament degradat. L'ADN és llavors purificat utilitzant mètodes senzills per eliminar la contaminació de proteïnes (extracció amb fenol), ARN (ribonucleasa) i molècules més petites (precipitació i/o cromatografia). Els mètodes de reacció en cadena de la polimerasa (PCR) són sovint utilitzats per l'amplificació de seqüències específiques d'ARN o ADN (RT-PCR) prèviament al clonatge molecular.
L'ADN pel clonatge també pot ser obtingut a partir d'ARN fent servir transcriptasa inversa (ADN complementari o clonatge a partir de cDNA), o a partir d'ADN sintètic (síntesi artificial de gens). El clonatge a partir de cDNA és normalment utilitzat per obtenir clons representatius de la població de ARNm de les cèl·lules d'interès, mentre que l'ADN sintètic serveix per obtenir qualsevol seqüència precisa definida pel dissenyador.
L'ADN purificat és llavors tractat amb un enzim de restricció per generar fragments amb els finals capaços de ser enllaçats als del vector. Si és necessari, segments curts d'ADN bicatenari (linkers) contenint llocs de restricció poden ser afegits per crear estructures finals que són compatibles amb el vector.
Creació de l'ADN recombinant amb ADN-ligasa La creació de l'ADN recombinant és per diverses raons el pas més senzill del procés de clonatge molecular. L'ADN preparat a partir del vector i el fragment d'ADN estranger són senzillament barrejats amb les concentracions apropiades i exposats a l'acció d'un enzim, (ADN-ligasa), que uneix covalentment els finals. Aquesta reacció d'unió és sovint anomenada lligació. La mescla resultant és llavors a punt per a la seva introducció a l'organisme amfitrió.
L'ADN-ligasa només reconeix i actua sobre els finals de molècules d'ADN lineal, normalment resultant en una mescla complexa de molècules d'ADN amb finals units a l'atzar. Els productes desitjats (ADN vector covalentment enllaçat a l'ADN estranger) hi són presents, però normalment altres seqüències (p. ex. ADN estranger enllaçat a ell mateix, ADN vector enllaçat a ell mateix i combinacions de múltiples vectors i fragments d'ADN estranger en una única molècula d'ADN) també hi són presents. Aquesta mescla complexa és triada en els passos subsegüents del procés de clonatge, després que la mescla d'ADN sigui introduïda a les cèl·lules.
Introducció de l'ADN recombinant a l'organisme amfitrió