La síntesi gènica artificial, o simplement síntesi gènica, fa referència a un grup de mètodes que s'utilitzen en biologia sintètica per construir i assemblar gens a partir de nucleòtids de novo. A diferència de la síntesi d'ADN en cèl·lules vives, la síntesi gènica artificial no requereix ADN motlle, cosa que permet sintetitzar pràcticament qualsevol seqüència d'ADN al laboratori. Comprèn dos passos principals, el primer dels quals és la síntesi d'ADN en fase sòlida, de vegades coneguda com a impressió d'ADN. Això produeix fragments d'oligonucleòtids que generalment tenen menys de 200 parells de bases. El segon pas implica connectar aquests fragments d'oligonucleòtids mitjançant diversos mètodes d'assemblatge d'ADN. Com que la síntesi gènica artificial no requereix ADN motlle, teòricament és possible fer una molècula d'ADN completament sintètica sense límits en la seqüència de nucleòtids ni en la mida.
La síntesi del primer gen complet, un tRNA de llevat, va ser demostrada per Har Gobind Khorana i els seus col·laboradors el 1972. La síntesi dels primers gens codificants de pèptids i proteïnes es va dur a terme als laboratoris de Herbert Boyer i Alexander Markham, respectivament. Més recentment, s'han desenvolupat mètodes artificials de síntesi gènica que permetran l'acoblament de cromosomes i genomes sencers. El primer cromosoma sintètic de llevat es va sintetitzar el 2014, i també s'han sintetitzat cromosomes bacterians funcionals sencers. A més, la síntesi gènica artificial podria en el futur fer ús de nous parells de nucleobases (parells de bases no naturals).
Mètodes estàndard per a la síntesi d'ADN Síntesi d'oligonucleòtids Els oligonucleòtids es sintetitzen químicament utilitzant blocs de construcció anomenats fosforamidites de nucleòsids. Aquests poden ser nucleòsids normals o modificats que tenen grups protectors per evitar que les seves amines, grups hidroxil i grups fosfat interactuïn incorrectament. S'afegeix una fosforamidita a la vegada, es desprotegeix el grup hidroxil 5' i s'afegeix una nova base, i així successivament. La cadena creix en direcció 3' a 5', que és en sentit invers respecte a la biosíntesi. Al final, s'eliminen tots els grups protectors. No obstant això, en ser un procés químic, es produeixen diverses interaccions incorrectes que donen lloc a alguns productes defectuosos. Com més llarga sigui la seqüència d'oligonucleòtids que es sintetitza, més defectes hi haurà, per la qual cosa aquest procés només és pràctic per produir seqüències curtes de nucleòtids. El límit pràctic actual és d'uns 200 bp ( parells de bases) per a un oligonucleòtid amb una qualitat suficient per ser utilitzat directament per a una aplicació biològica. L'HPLC es pot utilitzar per aïllar productes amb la seqüència adequada. Mentrestant, es pot sintetitzar un gran nombre d'oligos en paral·lel en xips gènics. Per a un rendiment òptim en procediments posteriors de síntesi gènica, s'han de preparar individualment i a escales més grans.
Connexió d'oligonucleòtids basada en el recuit Normalment, es crea un conjunt d'oligonucleòtids dissenyats individualment en sintetitzadors de fase sòlida automatitzats, es purifica i després es connecta mitjançant un recuit específic i reaccions de lligadura o polimerasa estàndard. Per millorar l'especificitat del recuit d'oligonucleòtids, el pas de síntesi es basa en un conjunt d'enzims ADN lligasa i polimerasa termoestables. Fins ara, s'han descrit diversos mètodes per a la síntesi de gens, com ara la lligadura d'oligonucleòtids superposats fosforilats, el mètode Fok I i una forma modificada de reacció en cadena de lligasa per a la síntesi de gens. A més, s'han descrit diversos enfocaments d'assemblatge de PCR. Normalment utilitzen oligonucleòtids de 40-50 nucleòtids de longitud que se superposen entre si. Aquests oligonucleòtids estan dissenyats per cobrir la major part de la seqüència d'ambdues cadenes, i la molècula de longitud completa es genera progressivament mitjançant PCR d'extensió superposada (OE), PCR termodinàmicament equilibrada de dins cap a fora (TBIO) o enfocaments combinats. Els gens sintetitzats més habitualment tenen una mida que oscil·la entre els 600 i els 1.200 pb, tot i que s'han creat gens molt més llargs connectant fragments prèviament assemblats de menys de 1.000 pb. En aquest rang de mida cal provar diversos clons candidats que confirmin la seqüència del gen sintètic clonat mitjançant mètodes de seqüenciació automatitzats.
Limitacions A més, com que l'acoblament del producte gènic de longitud completa es basa en l'alineació eficient i específica d'oligonucleòtids monocatenaris llargs, els paràmetres crítics per a l'èxit de la síntesi inclouen regions de seqüència estesa que comprenen estructures secundàries causades per repeticions invertides, un contingut de GC extraordinàriament alt o baix o estructures repetitives. Normalment, aquests segments d'un gen concret només es poden sintetitzar dividint el procediment en diversos passos consecutius i un acoblament final de subseqüències més curtes, cosa que al seu torn condueix a un augment significatiu del temps i la mà d'obra necessaris per a la seva producció. El resultat d'un experiment de síntesi gènica depèn en gran manera de la qualitat dels oligonucleòtids utilitzats. Per a aquests protocols de síntesi gènica basats en el recuit, la qualitat del producte depèn directament i exponencialment de la correcció dels oligonucleòtids emprats. Alternativament, després de realitzar la síntesi gènica amb oligos de menor qualitat, cal fer més esforços en l'assegurament de la qualitat posterior durant l'anàlisi de clons, que normalment es fa mitjançant procediments estàndard de clonació i seqüenciació que requereixen molt de temps. Un altre problema associat a tots els mètodes actuals de síntesi gènica és l'alta freqüència d'errors de seqüència a causa de l'ús d'oligonucleòtids sintetitzats químicament. La freqüència d'errors augmenta amb oligonucleòtids més llargs i, com a conseqüència, el percentatge de producte correcte disminueix dràsticament a mesura que s'utilitzen més oligonucleòtids. El problema de la mutació es podria resoldre utilitzant oligonucleòtids més curts per assemblar el gen. Tanmateix, tots els mètodes d'assemblatge basats en el recuit requereixen que els encebadors es barregin en un sol tub. En aquest cas, els solapaments més curts no sempre permeten un recuit precís i específic dels encebadors complementaris, cosa que resulta en la inhibició de la formació del producte de longitud completa. El disseny manual d'oligonucleòtids és un procediment laboriós i no garanteix la síntesi reeixida del gen desitjat. Per a un rendiment òptim de gairebé tots els mètodes basats en el recuit, se suposa que les temperatures de fusió de les regions superposades són similars per a tots els oligonucleòtids. L'optimització necessària dels encebadors s'ha de realitzar mitjançant programes especialitzats de disseny d'oligonucleòtids. Fins ara s'han presentat diverses solucions per al disseny automatitzat d'encebadors per a la síntesi de gens.
Procediments de correcció d'errors Per superar els problemes associats amb la qualitat dels oligonucleòtids, s'han desenvolupat diverses estratègies elaborades, que utilitzen oligonucleòtids de pesca preparats per separat, enzims d'unió a mutacions de la família mutS o endonucleases específiques de bacteris o fags. No obstant això, totes aquestes estratègies augmenten el temps i els costos de la síntesi gènica basada en l'alineació d'oligonucleòtids sintetitzats químicament.
La seqüenciació massivament paral·lela també s'ha utilitzat com a eina per cribrar biblioteques d'oligonucleòtids complexes i permetre la recuperació de molècules precises. En un enfocament, els oligonucleòtids es seqüencian a la plataforma de piroseqüenciació 454 i un sistema robòtic captura imatges i selecciona perles individuals corresponents a la seqüència precisa. En un altre enfocament, una biblioteca d'oligonucleòtids complexa es modifica amb etiquetes de flanqueig úniques abans de la seqüenciació massivament paral·lela. Els encebadors dirigits per etiquetes permeten la recuperació de molècules amb les seqüències desitjades mitjançant PCR amb dial-out.
Cada cop més, els gens s'ordenen en conjunts que inclouen gens funcionalment relacionats o múltiples variants de seqüència en un sol gen. Pràcticament totes les proteïnes terapèutiques en desenvolupament, com ara els anticossos monoclonals, s'optimitzen provant moltes variants gèniques per millorar la funció o l'expressió. L'optimització de codons té aplicacions en el disseny de gens sintètics i vacunes d'ADN. Les eines recents inclouen models d'aprenentatge automàtic com ara ColiFormer, que utilitzen característiques de seqüència per guiar l'optimització de codons; hi ha una implementació oberta disponible com a Hugging Face Space públic.
Parells de bases no naturals Mentre que la síntesi tradicional d'àcids nucleics només utilitza 4 parells de bases: adenina, timina, guanina i citosina, la síntesi d'oligonucleòtids en el futur podria incorporar l'ús de parells de bases no naturals, que són nucleobases dissenyades i sintetitzades artificialment que no es produeixen a la natura.
El 2012, un grup de científics nord-americans dirigit per Floyd Romesberg, biòleg químic del Scripps Research Institute de San Diego, Califòrnia, va publicar que el seu equip havia dissenyat un parell de bases no naturals (UBP). Els dos nous nucleòtids artificials o parell de bases no naturals (UBP) es van anomenar d5SICS i dNaM. Més tècnicament, aquests nucleòtids artificials que porten nucleobases hidrofòbiques presenten dos anells aromàtics fusionats que formen un complex o parell de bases (d5SICS-dNaM) a l'ADN. El 2014, el mateix equip del Scripps Research Institute va informar que van sintetitzar un tram d'ADN circular conegut com a plasmidi que conté parells de bases TA i CG naturals juntament amb el UBP de millor rendiment que el laboratori de Romesberg havia dissenyat, i el van inserir en cèl·lules del bacteri comú E. coli que van replicar amb èxit els parells de bases no naturals al llarg de múltiples generacions. Aquest és el primer exemple conegut d'un organisme viu que transmet un codi genètic expandit a les generacions posteriors. Això es va aconseguir en part mitjançant l'addició d'un gen d'alga de suport que expressa un transportador de nucleòtids trifosfat que importa eficientment els trifosfats tant de d5SICSTP com de dNaMTP als bacteris E. coli. Aleshores, les vies naturals de replicació bacteriana les utilitzen per replicar amb precisió el plasmidi que conté d5SICS-dNaM.
La incorporació amb èxit d'un tercer parell de bases és un avenç significatiu cap a l'objectiu d'ampliar considerablement el nombre d'aminoàcids que pot codificar l'ADN, dels 20 aminoàcids existents a uns 172 teòricament possibles, ampliant així el potencial dels organismes vius per produir noves proteïnes. En el futur, aquests parells de bases no naturals es podrien sintetitzar i incorporar a oligonucleòtids mitjançant mètodes d'impressió d'ADN.
Assemblament d'ADN