náhled|Zvětšený snímek dvoukanálového DNA čipu s výřezem v ještě větší velikosti. Tento čip obsahuje celkem asi 40000 vlastností náhled|DNA čipy od firmy Affymetrix DNA čip (často i v našem prostředí nazýván anglickým názvem DNA microarray) je technologie umožňující molekulárně-biologické analýzy výrazně paralelního rázu, především analýzu exprese genů.
Jedná se o destičku (povětšinou skleněnou nebo silikonovou), s mnoha (běžně desetitisíci, výjimečně až miliony) vzorky jednovláken DNA oligonukleotidů. Tyto vzorky se nazývají vlastnosti (features) a každý z nich obsahuje několik molekul jednoho konkrétního DNA oligonukleotidu. Po kontaktu takovéto destičky s testovaným vzorkem – směsí označených DNA oligonukleotidů – molekuly vzorku (nazývané cílové) hybridizují s komplementárními molekulami přichycenými na destičce. Poté jsou (typicky na bázi fluorescence) detekována místa, kde došlo k hybridizaci a je tak zjištěno, jaké molekuly oligonukleotidů vzorek obsahoval.
I jediný experiment produkuje velké množství dat, proto je pro porozumění výsledků takřka vždy nutné použít metody bioinformatiky. V dnešní době existuje několik firem, produkujících DNA čipy komerčně (např. Affymetrix, Agilent Technologies, Eppendorf či Illumina), rovněž jsou ale hojně vytvářeny přímo ve výzkumných laboratořích pro vlastní potřebu. Obdobou DNA čipů jsou RNA čipy a proteinové čipy.
Historie DNA microarray Za počátky DNA microarray se pokládá hybridizace kolonií bakterie E. coli provedená Grunsteinem a Hognesem, 1975. Bakterie E. coli obsahují různorodé hybridní plazmidy a díky jejich metodě bylo možné rychle zjistit specifické sekvence DNA nebo geny, které se na daném plazmidu nacházejí. Kolonie E. coli byly přesunuty na nitrocelulózový filtr, zlyzovány a jejich DNA byla denaturována a přichycena na filtr in situ. Poté se pomocí přihybridizované radioaktivní RNA označila místa zájmu na DNA. Grundstein a Hognes pomocí této metody izolovali kolonie obsahující plazmid s genem z Drosophily melanogaster pro 18 a 28S rRNA. Na počátku 90. let skupina Hanse Lehracha zautomatizovala tento proces pomocí robotického systému, který rychle uspořádával klony z destičky na filtr. Na přelomu tisíciletí došlo k rychlému pokroku zapojením fluorescenční detekce, která je citlivější a levnější než radioaktivní značení. Začaly se využívat delší sekvence (25-60 bp) díky rozšíření sekvenování genomů, a s tím souvisejícím rozvojem databází genomů. Tyto inovace vedly ke zvýšení specificity čipů. Například byl vytvořen referenční čip pro člověka, Lennon 1996. Byly vyvinuty 3 rozdílné typy mikročipů: „čipy na sklíčku“ (spotted arrays on glas), „samo skládající se čipy“ (self assembled arrays) a „in situ syntetizované čipy“ (in situ synthesized arrays).
Princip a technologie Metoda DNA čipů je založena na paralelní hybridizaci značených sekvencí nukleových kyselin ze vzorku se specifickými sondami ukotvenými na podkladu. Fixováním sond na pevný povrch je umožněno je prostorově oddělit a paralelizovat hybridizační reakce. Nukleotidová sekvence je základem pro specificitu daných sond. Od konce 20. let došlo k masivnímu rozvoji této technologie, nejenom k její adaptaci k mnoha různým účelům, ale i k vývoji řady dalších jejích variací. Vzhledem k prudkému rozvoji na trhu komerčních DNA čipů a tím se zvyšující konkurence, se efektivně snižuje finanční náročnost této technologie.
Rozdělení V současnosti jsou používané technologie značně rozdílné a můžeme je rozdělit do různých kategorií.
Podle počtu sond Nízkohustotní ("low-density")
Nesoucí desítky až stovky specifických oligonukleotidových sond, přidělaných na speciální membrány nebo podložní sklíčka. Často zaměřeny na analýzu specifických signálních drah nebo na soubory biomarkerů.
Vysokohustotní ("hish-density")
Nesoucí tisíce až miliony specifických sond, umožňujících stanovení exprese jednotlivých exonů, velmi podrobné mapování úseku genomové DNA, genotypizaci statisíců jednonukleotidových polymorfismů nebo resekvenování rozsáhlých úseků DNA. Zaměřeny na výzkum v oblasti analýzy genomové DNA nebo exprese RNA.
Podle druhu sond Oligonukleotidové
Nejrozšířenější typ DNA čipů v současnosti, neboť je použitelný pro skoro všechny aplikace. Existují dva druhy, s krátkými nebo dlouhými oligonukleotidy.
cDNA (komplementární "complementary" DNA)
V současnosti téměř kompletně vytlačena dlouhými oligonukleotidy. Komplementární DNA (cDNA) je syntetizována reversní transkripcí z RNA templátu pomocí enzymu reversní transkriptáza (RT).
BAC (bakteriální artificiální chromozomy) , PAC (P1-odvozené arteficiální chromozomy)
Využívány ke konstrukci DNA čipů pro komparativní genomovou hybridizaci.
Podle technologie přípravy (viz Výroba) Depotované ("spotované") In-situ syntetizované "Bead arrays"
Podle způsobu značení vzorků Fluorescenční
Nejrozšířeněji používaná metoda značení. Dovoluje současnou analýzu více vzorků označených různými spektrálně se nepřekrývajícími fluorofory. Vzorek tedy při analýze bude svítit více barvami. Nejčastěji používanými fluorescenčními barvivy jsou například Cyanine 3, Cyanine 5 a FITC. Existují dvě hlavní skupiny značení vzorků. Mezi první skupinu metod patří inkorporace značených nebo speciálně upravených nukleotidů do RNA nebo DNA během přípravy vzorků. Dělí se na značení přímé ("direct labeling") a nepřímé ("indirect labeling"). U přímého jsou přímo zabudovány fluorescenčně značené nukleotidy. U nepřímého jsou nejprve inkorporovány speciálně upravené nukleotidy, na které je následně navázáno vlastní fluorescenční barvivo nebo nukleotidy značené biotinem, které jsou poté detekovány pomocí streptavidinu konjugovaného s fluorescenčním barvivem. Druhá skupina využívá tzv. koncové značení ("end labeling"). Značené nukleotidy jsou připojeny na 3´ nebo 5´ konec DNA/RNA určené k hybridizaci pomocí specifických enzymů jako TdT (terminální deoxynukleotidyl transferáza) nebo T4 RNA ligáza. Dále existuje neenzymatické značení nukleových kyselin, kdy je fluorescenční barvivo navázáno na adaptér, schopný pevné vazby s DNA, RNA i proteiny.
Chemiluminiscenční Radionuklidové
Podle počtu snímaných barev Jednokanálové
Tuto techniku upřednostňují velké firmy dodávající komerční výrobky (Affymetrix, Illumina).
Dvoukanálové
Dvoubarevná metoda umožňuje sledovat větší počet analyzovaných vzorků a porovnat dva vzorky za naprosto stejných experimentálních podmínek.
Vícekanálové
Nejméně rozšířená metoda, neboť dochází k překryvu fluoroforů a neexistují spolehlivé statistické metody pro analýzu vícebarevných uspořádání.
Podle aplikace RNA aplikace
3 možné aplikace: sledování exprese mRNA, exonů nebo krátkých RNA. Celkové zlepšování analytických a sekvenačních metod umožňuje detailní analýzy transkriptomu pomocí DNA čipů. Exonové DNA čipy obsahují reprezentativní sondy pro jednotlivé exony a ne pro jednotlivé geny, což umožňuje podrobnější a kvalitativně lepší analýzu genové exprese a alternativního sestřihu exprimovaných genů. Studium krátkých RNA pomocí DNA microarray je obtížné hlavně kvůli návrhu sond, které musí být dostatečně specifické i při velké sekvenční homologii různých krátkých RNA. Rozdíl mezi některými sekvencemi krátkých RNA může totiž být pouze jeden nukleotid.
DNA aplikace
5 možných aplikací: arrayCGH, genotypizace (SNP array), ChIP-on-chip, resekvenování a analýza methylace DNA. CGH, neboli komparativní genomová hybridizace je metoda umožňující analýzu celého genomu v jednom experimentu. ArrayCGH jsou určeny pro sledování změn v počtu kopií úseků DNA. Více používané jsou SNP ("single nucleotide polymorphism") microarray, které kombinují v jednom produktu dvě analýzy, genotypizaci a CNV ("copy number variation"). ChiP-on-chip ("Chromatin immunoprecipitation on chip") a analýza methylace DNA jsou epigenetické analýzy založené na metodě "tilling microarray". Ta využívá sondy s velikou hustotou pokrytí navržené tak, aby rovnoměrně pokrývaly určité úseky genomu. K resekvenování jsou v současné době používány především DNA s krátkými oligonukleotidy.náhled|Mikropole
Průběh experimentu DNA čip je založen na principu párování komplementárních bází nukleotidů – spojení vodíkovými můstky. Možných postupů při experimentu je více, tradiční experiment pro zjištění genů exprimovaných v jedné buňce v daném okamžiku lze popsat zhruba takto: Vytvoření DNA čipu: Vybrané DNA oligonukleotidy – jednovlákna (například části genů, genové reportéry) známých sekvencí, nazývaná sondy jsou speciálními metodami přichyceny k povrchu destičky pevnou kovalentní vazbou. Vždy několik stejných molekul na jednom místě tvoří tzv. vlastnost, vlastnosti jsou na destičce prostorově odděleny. Vytvoření vzorku: Typickým příkladem vzorku je všechna mRNA přítomná v určité buňce v určitém okamžiku. Vzorek musí být nejdříve purifikován ("vyčištěn"), (např. elektroforézou, PCR se specifickými primery) poté je reversní transkripcí převeden do cDNA. Dále může proběhnout amplifikace pomocí PCR pro zajištění dostatečného počtu molekul požadovaných typů ve vzorku a dělení molekul cDNA na kratší pomocí restrikčních endonukleáz. Během reverzní transkripce, PCR amplifikace či po nich probíhá nezbytný krok označení molekul. Ke každé molekule je připojeno několik molekul (typicky zhruba jedna na každých 60 bází) fluorescentní (popř. jiné, např. radioaktivní) látky, jejíž přítomnost, popř. množství bude možno později detekovat. Typickými fluorescenčními látkami používanými pro tyto pokusy jsou fluorofory. Molekuly vzorku jsou před aplikací na čip denaturovány. Výsledným vzorkem je tedy směs jednovláken DNA označených detekovatelnou látkou. Hybridizace vzorku s čipem: Po kontaktu s DNA čipem molekuly vzorku hybridizují s komplementárními sondami (molekulami na čipu). Čím větší je sekvenční podobnost (resp. komplementarita, viz nukleová báze) sond s molekulami vzorku, tím větší počet vodíkových můstků mezi nimi vznikne a tím pevnější je vazba. Omytí čipu: Po omytí zůstanou na čipu sondy, pevně přichycené kovalentní vazbou k jeho povrchu a molekuly vzorku přichycené dostatečně pevně na sondách. Molekuly vzorku přichycené na sondách nedostatečným počtem vodíkových můstků, tedy nedostatečně sekvenčně podobné, jsou odplaveny. Skenování čipu: Po Skenování čipu: Po excitaci laserem vyzáří molekuly barviva (způsob s použitím fluorescentního barviva) přítomné na molekulách vzorku přichycených na sondách světlo určité vlnové délky. Světlo vyzářené každou vlastností je detekováno. Zpracování výsledků: Předchozím postupem získáme informaci o tom, ke kterým sekvencím uchyceným na čipu existovaly komplementární sekvence ve vzorku. Podle intenzity vyzářeného světla lze určit i množství komplementárních molekul přítomných ve vzorku, běžně se ovšem pracuje pouze s relativním množstvím. Jsou tedy pouze porovnávána množství světla vyzářená jednotlivými vlastnostmi pro zjištění poměrů, v jakých byly jednotlivé sekvence ve vzorku přítomny. Zjištění absolutní koncentrace jednotlivých sekvencí ve vzorku je problematické. Charakter získaných dat vyžaduje pokročilé počítačové zpracování. Nejdříve je třeba digitální zpracování obrazu, získaná data jsou potom analyzovány metodami bioinformatiky. Analýza dat: Prvním z několika kroků je převod obrazové informace na numerická data, které je pak možno dále zpracovávat. Primární data jsou totiž v podobě digitalizovaného obrazu, protože k detekci vazby vzorku na čip jsou používány hlavně optické metody jako fluorescence nebo chemiluminiscence. Pro vlastní statistické zpracování je nutné data upravit tak, aby byl minimalizován vliv nebiologických zdrojů variability. K tomuto účelu slouží metody pro normalizaci dat. Normalizace umožňuje porovnání expresních hodnot genů mezi různými hybridizacemi nebo v případě dvoukanálových technik porovnání míry genové exprese ve vzorcích označených různými fluorofory.