náhled|upright|Jablonského diagram FRET přenosu mezi donorem a akceptorem náhled|Pokles fluorescence CFP (donor) a nárůst fluorescence YFP (akceptor) v důsledku FRET při jejich přibližování Försterův rezonanční přenos energie (FRET) či nesprávně Fluorescenční rezonanční přenos energie je mechanismus nezářivého přenosu energie mezi dvěma molekulami prostřednictvím dipól-dipólové interakce. Molekula, z níž se energie přenáší, se nazývá donor (dárce), kdežto molekula, která energii přijímá, se nazývá akceptor (příjemce).
Účinnost tohoto mechanismu je nepřímo úměrná šesté mocnině vzdálenosti mezi donorem a akceptorem, k jevu tedy prakticky dochází jen tehdy, jsou-li obě molekuly v těsné blízkosti. Z intenzity FRET (kterou lze určit různými metodami analýzy fluorescence vzorku) lze proto získat informaci o míře interakce mezi donorem a akceptorem. To je velmi cenné především při studiu živých buněk.
Historie Jedny z prvních experimentálních důkazu existence FRET získali roku 1922 G. Cairo a J. Franck. Pozorovali, že ozařují-li páry rtuti a thallia světlem o vlnové délce spadající do oblasti absorpce rtuti, dochází částečně ke fluorescenci thallia. Tento jev nazvali „senzibilizovaná fluorescence“. Na objasňování principu tohoto jevu se podíleli např. Jean-Baptiste Perrin, Francis Perrin, Hartmut Kallman či Fritz London. Se správným modelem však přišel až v roce 1948 Theodor Förster, po němž je dnes jev pojmenován.
Fyzikální popis
Klasický přístup
Odvození FRET je čistě elektromagnetickým jevem spočívajícím v nezářivém přenosu energie mezi dvěma dipóly (donorem a akceptorem) na vzdálenost podstatně menší, než je vlnová délka záření emitovaného kmitajícím donorem. K odvození správného vztahu pro FRET lze použít klasický popis. Energie Coulombické interakce mezi nabitými tělesy a s nábojovou hustotou a , vzdálenými od sebe , je
Provedeme-li multipólový rozvoj uvedeného potenciálu, dostaneme
kde .
Pro nenabité částice je nenulový pouze poslední ze členů v závorce, který odpovídá dipól-dipólové interakci. Právě tento člen je zodpovědný za existenci FRET, ale také např. za van der Waalsovské interakce. Ostatní členy pro jednoduchost zanedbáme, budeme tedy uvažovat, že akceptor je dipól indukovaný polem dipólu donoru.
Intenzitu FRET lze vyjádřit jako
kde poměr rychlostní konstanty přenosu energie z donoru na akceptor a rychlostní konstanty deexcitace donoru prostřednictvím jiných mechanismů (obě uvedené rychlostní konstanty mají hodnotu převrácených hodnoty příslušných dob života) je vyjádřen jako podíl energie absorbované akceptorem za jednotku času a energie vyzářené za jednotku času donorem v nepřítomnosti akceptoru . Hodnotu lze určit pomocí vztahu pro energii vyzařovanou dipólem kmitajícím s frekvencí :
Veličinu na základě Poyntingoy věty vyjádříme jako
kde je elektrické pole generované donorem a je proudová hustota asociovaná s přítomností akceptorového dipólu. Tu lze vyjádřit jako
čímž se () zjednoduší na
Jelikož je dipól indukovaný polem donoru, můžeme ho vyjádřit prostřednictvím tenzoru polarizovatelnosti akceptoru :
Za předpokladu, že akceptor lze polarizovat pouze ve směru vektoru jeho dipólového momentu (tedy že lze psát ), rovnice () přejde na
Po relativně složitém odvození (zahrnujícím vyjádření pomocí Greenovy funkce, středování vzájemné orientace donoru a akceptoru a další kroky) získáme důležitý vztah pro závislost FRET na vzdálenosti obou zúčastněných dipólů:
přičemž je tzv. Försterova vzdálenost. Ze vztahu vyplývá, že intenzita FRET se vzdáleností silně klesá, přičemž intenzitě ostatních deexcitačních procesů se vyrovná, je-li vzdálenost donoru a akceptoru právě . Typické hodnoty jsou 1-10 nm.
Försterovu vzdálenost lze vyjádřit jako
Zde je emisní spektrum donoru, je index lomu prostředí. Veličina představuje účinný průřez akceptoru pro danou frekvenci , který vyjadřuje schopnost akceptoru na dané frekvenci absorbovat:
FRET tedy závisí na překryvu emisního spektra donoru a absorpčního spektra akceptoru.
Faktor , který v () rovněž figuruje, vyjadřuje závislost FRET na vzájemné orientaci donoru a akceptoru:
náhled|upright|Hodnoty orientačního faktoru pro tři význačné vzájemné orientace donoru vůči akceptoru
Vektor , resp. je jednotkový vektor ve směru dipólového momentu akceptoru, resp. donoru a je jednotkový vektor ve směru spojnice donoru a akceptoru.
Výraz může nabývat hodnot mezi 0 a 4. Minimální hodnotu 0 má v případě, že oba dipólové momenty jsou na sebe kolmé. Hodnotu 1 má v případě, že jsou rovnoběžné a zároveň kolmé na . Maximální hodnotu 4 má v případě, že oba dipóly leží v jedné přímce.
Stojí za povšimnutí, že (a tedy i intenzita FRET) má nejvyšší hodnotu, leží-li akceptor ve směru osy dipólu donoru. Hodnota je zde nenulová, na základě výrazu () tedy k přenosu energie může dojít, a to přesto, že v aproximaci dalekého pole se tímto směrem nešíří žádné elektromagnetické vlny. Proto se jedná o „nezářivý přenos“.
V případě, kdy se donor i akceptor v roztoku průběžně náhodně reorientují, vystředuje se na hodnotu . Jsou-li naopak donor a akceptor částečně či zcela fixovány (na stejné makromolekule či v membráně), může se od hodnoty odchylovat. FRET pak může poskytnout informaci o vzájemné orientaci donoru a akceptoru.
Účinnost FRET náhled|upright|Tři nutné podmínky FRET: překryv emisního spektra donoru a absorpčního spektra akceptoru, malá vzdálenost (do cca 10 nm), vhodná vzájemná orientace zúčastněných molekul FRET lze alternativně popsat prostřednictvím účinnosti, která se spočítá jako kvantový výtěžek příslušného přechodu, tedy podíl uskutečněných přenosů vzhledem k počtu excitací. Lze ji též vyjádřit pomocí rychlostních konstanty FRET a rychlostní konstanty reprezentující ostatní deexcitační jevy:
To lze po dosazení z () upravit na
Pomocí dob života lze účinnost FRET vyjádřit jako
kde a jsou doby života excitovaných stavů donoru v přítomnosti, resp. absenci akceptoru.
Aby byla účinnost FRET nenulová, musí být splněny 3 základní podmínky:
Překryv spekter: donor musí fluoreskovat a jeho emisní spektrum se musí alespoň částečně překrývat s absorpčním spektrem akceptoru. Akceptor naopak nemusí být fluoroforem. Vzdálenost: donor a akceptor od sebe nesmí být dál než několik nanometrů. Orientace: donor a akceptor vůči sobě nesmí být natočené tak, aby orientační faktor byl nulový
Kvantový přístup V rámci kvantové teorie pole lze interakce mezi částicemi obecně popsat s pomocí Feynmanových diagramů jako výměnu tzv. virtuálních částic. FRET lze proto popsat jako výměnu virtuálních fotonů mezi donorem a akceptorem.
Aplikace V biofyzice a biochemii FRET představuje užitečný nástroj umožňující in vivo kvantifikaci buněčných dějů jako jsou interakce molekul či jejich konformační změny (je ovšem třeba mít k dispozici metodu, kterou lze na tyto molekuly připevnit vhodný donor, resp. akceptor). Lze tak však získat pouze informaci o průměrných vzdálenostech donoru a akceptoru (s výjimkou metody smFRET).
Konkrétně se FRET uplatňuje např. v následujících oblastech:
studium struktury a konformace proteinů metoda imunoassay studium struktury a konformace nukleových kyselin real-time PCRDidenko VV: DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. In: BioTechniques. 31, Nr. 5, November 2001, S. 1106–16, 1118, 1120–1. . PMC: 1941713 (freier Volltext) studium distribuce a transportu lipidů studium fúze membrán v přírodě se FRET uplatňuje při svádění světelné energie ze světlosběrné antény do reakčního centra fotosystémuLaible PD et al.: Detailed Balance in Förster–Dexter Excitation Transfer and Its Application to Photosynthesis. In: J. Phys. Chem. B. 102, Nr. 9, 1998, S. 1641–1648.doi:10.1021/jp9730104Hochspringen↑ Kê, Bacon: Photosystem II. In: Photosynthesis: photobiochemistry and photobiophysics. Kluwer Academic, 2001, , S. 199-322
Metody měření FRET
Senzitizovaná emise Jelikož FRET vede ke snížení intenzity fluorescence donoru, lze jej z měření tohoto poklesu teoreticky určit. Je-li , resp. intenzita fluorescence donoru v nepřítomnosti, resp. přítomnosti akceptoru, pak účinnost FRET lze vyjádřit jako
V praxi však vždy představuje komplikaci tzv. crosstalk, neboli skutečnost, že excitační, resp. emisní spektra donoru a akceptoru se alespoň částečně překrývají. V případě překryvu excitačních spekter pak dochází k nežádoucí přímé excitaci akceptoru, který následně může fluoreskovat i v případě, kdy k FRET nedochází.
V případě překryvu emisních spekter fluorescence donoru a akceptoru částečně splývají. To do měření rovněž vnáší nepřesnost, neboť pokles fluorescence donoru v důsledku FRET se pak jeví menší než ve skutečnosti je.
Proto je nutné zároveň se vzorkem obsahujícím donor i akceptor měřit i kontroly obsahující pouze donor, resp. pouze akceptor, a tyto kontroly od samotného vzorku odečíst. To však ve výsledném obraze zvyšuje úroveň šumu. Pro měření malých signálů proto metoda senzitizované emise není příliš vhodná.
Vybělování akceptoru
náhled|Po vybělení akceptoru jeho fluorescence zmizí, kdežto fluorescence donoru stoupne Fluoreskuje-li kromě donoru též akceptor, lze k určení intenzity FRET též využít jeho vybělování. Měření sestává z následujících kroků: Měření fluorescence donoru ve vzorku s donorem i akceptorem Vybělení akceptoru Měření fluorescence donoru ve vzorku s donorem a vyběleným akceptorem
V prvním kroku je měřená fluorescence donoru umenšovaná přenosem energie na akceptor prostřednictvím FRET. Po vybělení akceptoru je FRET znemožněn, z rozdílu signálu lze tedy velikost FRET určit.
Výhodou této metody je oproti senzitizované emisi to, že stačí měřit jediný vzorek. Nevýhodou je, že vzorek lze změřit pouze jednou, neboť vybělení akceptoru je nevratné. Ve vzorku tedy nelze sledovat dynamiku procesů.
Měření dob života fluorescence náhled|upright|Srovnání konvenční fluorescenční mikroskopie (A, D) a FLIM (snímky: B, E, histogramy: C, F). Obrázky představují obarvená buněčná jádra; tmavší oblasti odpovídají místům, kde v důsledku přítomnosti akceptoru dochází k FRET Všechny fluorofory vykazují (multi)exponenciální dohasínání, typicky na nanosekundových škálách. Rychlost dohasínání přitom závisí na řadě faktorů a jevů (včetně FRET), které fluorescenci zháší. Právě toho metoda měření dob života využívá. Postup je podobný jako u metody vybělování akceptoru: napřed se provede měření doby života fluorescence donoru na vzorku s donorem i akceptorem, posléze je akceptor vybělen a vzorek je změřen znovu. Intenzita FRET je potom stanovena z rozdílu v obou vzorcích.
Měření dob života představuje poměrně precizní metodu určování FRET. Vzhledem k tomu, že je sledována pouze fluorescence donoru, může jako akceptor sloužit i nefluorescenční molekula, díky čemuž nedochází k přeslechům v emisních spektrech.
Mezi nevýhody patří, že dobu života fluorescence donoru ovlivňují kromě přítomnosti akceptoru i další faktory prostředí, jako jsou např. změny pH. Aparatury schopné měření časově rozlišené fluorescence na nanosekundových škálách se též vyznačují vyšší cenou.
Měření dob života fluorescence se využívá při technice Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM). Obrazy vzorku pořízené touto metodou odráží rozdíly v dobách života fluorescence v jeho různých místech.
Měření polarizace (Homo-FRET) Zkratka “FRET” obvykle označuje techniky, při nichž se používá akceptor jiného typu (chemického složení), než je donor. V mnoha situacích je však zapotřebí studovat interakce mezi proteiny stejného typu, nebo dokonce interakci různých částí stejné proteinové molekuly (skládání neboli folding), které jsou značeny stejným fluoroforem (odtud Homo-FRET).
V takovémto případě, kdy donor zároveň plní roli akceptoru (to je možné za předpokladu, že se jeho excitační a emisní spektrum částečně překrývají), nelze FRET měřit sledováním spektrálních změn, neboť emisní spektra obou zúčastněných molekul jsou shodná.