náhled|Kyvety pro elektroporaci bakterií náhled|Představy o struktuře pórů v membráně buněk - dva modely Elektroporace nebo také elektropermeabilizace je mikrobiologická technika, při které je na buňky aplikováno elektrické pole za účelem zvýšení propustnosti buněčné membrány, což umožňuje průnik chemikálií, léků, elektrod nebo DNA do buňky (elektrotransfer). Proces elektroporace je často využíván zejména k transformaci bakterií, kvasinek nebo rostlinných protoplastů zavedením nové kódující DNA.
K tomuto účelu bývají využívány plazmidy, které lze do bakteriálních buněk cíleně aplikovat právě po elektroporaci. V závislosti na tom, jaký materiál je do buňky vpravován, lze také použít peptidy pronikající do buněk (CPP) nebo technologii CellSqueeze. Elektroporace funguje na principu působení elektrického napětí tisíců voltů (~8 kV/cm) na buňky suspendované v elektroporační kyvetě. Poté proběhne proces buněčného dělení, jehož produktem jsou dceřiné buňky, které obsahují reprodukované plazmidy. Tento proces je při zvyšování propustnosti buněčné membrány přibližně desetkrát účinnější než při využití chemické transformace.
Elektroporace je také vysoce účinná při inserci cizích genů do buněk tkáňových kultur, zejména buněk savců. Využívá se tak například při produkci knockout myší, v oblasti onkologické terapie, nebo při genové a buněčné terapii. Proces zavádění cizí DNA do eukaryotických buněk je známý jako transfekce. Pro účely transfekce buněk v suspenzi pomocí elektroporačních kyvet je elektroporace vysoce efektivní metodou zvyšování prostupnosti buněčné membrány. Ukázala se jako velmi účinná i pro použití na tkáních in vivo, pro aplikace in utero a také pro transfekci in ovo. Adherentní buňky mohou být taktéž transfekovány pomocí elektroporace. To vědeckým pracovníkům poskytuje funkční alternativu k trypsinizaci buněk před transfekcí. Nevýhodou elektroporace však je, že po provedení procesu může být ovlivněna genová exprese více než 7 000 genů. To může způsobit problémy ve studiích, ve kterých musí být genová exprese kontrolována, aby byly zajištěny správné a přesné výsledky.
Přestože elektroporace má mnoho výhod oproti fyzikálním metodám, jako jsou mikroinjekce a genové zbraně, stále má i své slabiny. Tou je například nízká životaschopnost elektroporovaných buněk. Z tohoto důvodu byla provedena studie týkající se miniaturizace elektroporace, která vedla ke vzniku mikroelektroporace a nanotransfekce tkáně pomocí technik založených na elektroporaci prostřednictvím nanokanálů k minimálně invazivnímu dodání požadovaného materiálu do buněk.
Elektroporace je také používána jako mechanismus ke spuštění buněčné fúze. Uměle vyvolanou buněčnou fúzi lze použít ke výzkumu a léčbě různých onemocnění, jako např. diabetes, regeneraci axonů centrálního nervového systému a produkci buněk s požadovanými vlastnostmi, například v buněčných vakcínách pro onkologickou imunoterapii. První a nejznámější aplikací buněčné fúze byla produkce monoklonálních protilátek v hybridomové technologii, kdy hybridní buněčné linie (hybridomy) vznikají fúzí B lymfocytů produkujících specifické protilátky s myelomovou (rakovina B lymfocytů) buněčnou linií.
Historie V 60. letech 20. století bylo známo, že aplikací vnějšího elektrického pole lze vytvořit velký membránový potenciál na dvou pólech buňky. V návaznosti na to bylo v 70. letech zjištěno, že když membránový potenciál dosáhne kritické úrovně, membrána se rozpadne, přičemž je její struktura schopna se znovu obnovit. V 80. letech 20. století začal být tento mechanismus používán k zavádění různých materiálů/molekul do buněk.
Laboratorní praxe Elektroporace se provádí pomocí elektroporátorů – účelových spotřebičů, které vytvářejí elektrostatické pole v roztocích buněk. Suspenze buněk je pipetována do skleněné nebo plastové kyvety, která má po stranách dvě hliníkové elektrody. Pro bakteriální elektroporaci je obvykle používána suspenze o objemu přibližně 50 mikrolitrů. Nejprve se tato suspenze bakterií smíchá s plazmidy, které mají být insertovány do bakteriálních buněk. Směs se napipetuje do kyvety, nastaví se napětí a kapacita a kyveta se vloží do elektroporátoru. Proces vyžaduje přímý kontakt mezi elektrodami a suspenzí. Ihned po elektroporaci se k bakteriím přidá jeden mililitr kapalného média (v kyvetě nebo v Eppendorfově zkumavce) a zkumavka se inkubuje při optimální teplotě bakterií po dobu nejméně jedné hodiny, aby buňkám bylo umožněno zacelení buněčné membrány a exprese insertovaných plasmidů. Tato transformovaná bakteriální kultura je pak kultivována na agarových plotnách.
Úspěch elektroporace se vždy odvíjí od čistoty roztoku plazmidů, zejména od obsahu solí. Vysoké koncentrace solí mohou v plazmidových roztocích způsobit elektrický výboj (známý jako oblouk), jehož následkem je pak snížena životaschopnost bakterií. Pro další podrobné zkoumání tohoto procesu by měla být věnována větší pozornost výstupní impedanci porátorového zařízení a vstupní impedanci suspenze buněk (již zmíněný obsah solí).
Jelikož buněčná membrána není schopna propouštět proud (s výjimkou iontových kanálů), chová se jako elektrický kondenzátor. Vystavení membrán vysokonapěťovému elektrickému poli má za následek jejich dočasné zhroucení, což způsobuje vznik pórů, které jsou dostatečně velké na to, aby umožnily makromolekulám (jako je DNA) vstoupit do buňky nebo ji opustit.
Kromě toho lze elektroporaci využít ke zvýšení permeability buněk in vivo a to např. během in utero injekcí, či operací. Elektroporace při těchto procesech umožňuje účinnější transfekci DNA, RNA, shRNA a všech nukleových kyselin do buněk myší a krys. Úspěch elektroporace in vivo závisí zejména na napětí, opakování, pulzech a délce trvání tohoto procesu. Nejvýhodnější je in vivo elektroporaci provádět na vyvíjejícím se centrálním nervovém systému. V takovém případě je využíváno viditelnosti komor pro injekční aplikace nukleových kyselin a zvýšené permeability membrán dělících se buněk. Elektroporace in utero injekčně aplikovaných embryí se provádí přes stěnu dělohy, obvykle pomocí klešťových elektrod, aby byla omezena pravděpodobnost poškození embrya.
Studie in vitro a na zvířecích modelech In vivo genový elektrotransfer byl poprvé popsán v roce 1991. Dnes již existuje mnoho preklinických studií genového elektrotransferu. Metoda se používá k dodání široké škály terapeutických genů pro potenciální léčbu onemocnění, jako jsou například: poruchy imunitního systému, nádorová onemocnění, metabolické poruchy, monogenetická a kardiovaskulární onemocnění, analgezie apod.
Pokud jde o ireverzibilní elektroporaci, první úspěšnou léčbu maligních kožních nádorů implantovaných myším dokončila v roce 2007 skupina vědců, kteří dosáhli kompletní ablace tumorů u 12 ze 13 myší. Vyléčení u myší bylo dosaženo po aplikaci 80 pulzů o délce 100 mikrosekund při 0,3 Hz s velikostí elektrického pole 2500 V/cm. V současné době řada společností (např. AngioDynamics, Inc. a VoltMed, Inc.) pokračuje ve vývoji a využívání nevratných technologií založených na elektroporaci v klinických prostředích.
První skupinu, která se zabývala elektroporací pro lékařské aplikace, vedl Lluis M Mir z Institutu Gustava Roussyho. V tomto případě se zabývali využitím reverzibilní elektroporace ve spojení s nepermeabilními makromolekulami. První výzkum zaměřený na to, jak mohou být nanosekundové pulsy použity na lidských buňkách, provedli výzkumníci z Eastern Virginia Medical School a Old Dominion University a publikovali jej v roce 2003.
Využití elektroporace v medicíně První lékařská aplikace elektroporace byla použita pro zavádění málo permeantních protirakovinných léků do nádorových uzlů. Brzy se tak genový elektrotransfer stal předmětem zvláštního zájmu zejména pro svou nízkou cenu, snadnost realizace a bezpečnost. Konkrétně, virové vektory mají kvůli svým nedostatkům vážná omezení, pokud jde o imunogenicitu a patogenitu, jsou-li použity pro přenos DNA.
Při studiích prováděných na prasatech bylo zjištěno, že vyšší napětí při elektroporaci nevratně ničí cílové buňky v úzkém rozmezí, zatímco sousední buňky zůstávají nedotčeny, a tak představuje slibnou novou léčbu rakoviny, kardiovaskulárních chorob a dalších chorobných stavů, které vyžadují odstranění tkáně. Ireverzibilní elektroporace (IRE) se od té doby ukázala jako účinná při léčbě rakoviny u lidí, přičemž chirurgové v Johns Hopkins a dalších institucích nyní používají technologii k léčbě rakoviny slinivky břišní, která se dříve považovala za neresekovatelnou.
Mimo jiné byla také zrealizována první fáze klinické studie elektrotransferu genu u pacientů s metastatickým melanomem. Bylo provedeno elektroporací zprostředkované dodání plazmidu kódujícího gen pro interleukin-12 (pIL-12) a sledována byla bezpečnost, snášenlivost a terapeutický účinek. Studie dospěla k závěru, že genový elektrotransfer s pIL-12 je bezpečný a pacienty dobře snášený. Kromě toho byla částečná nebo úplná odpověď pozorována také u vzdálených neléčených metastáz, což naznačuje účinek systémové léčby. Na základě těchto výsledků je již v plánu přechod do fáze II klinické studie. V současné době probíhá několik klinických studií genového elektrotransferu, kde je sledována bezpečnost, snášenlivost a účinnost imunizace DNA vakcínou, která je aplikována elektrickými pulzy.
Přestože tato metoda není systémová, ale přísně lokální, stále jde o nejúčinnější nevirovou strategii pro přenos genů.
N-TIRE Nedávná technika nazývaná netermální ireverzibilní elektroporace (N-TIRE) se ukázala jako úspěšná při léčbě mnoha různých typů nádorů a dalších nežádoucích tkání. Tento postup se provádí pomocí malých elektrod (asi 1 mm v průměru), umístěných buď uvnitř nebo kolem cílové tkáně tak, aby bylo umožněno aplikovat krátké, opakující se výboje elektřiny při předem stanoveném napětí a frekvenci. Tyto výboje elektřiny zvyšují klidový transmembránový potenciál (TMP), takže se v plazmatické membráně tvoří nanopóry. Když je elektřina aplikovaná na tkáň nad prahem elektrického pole cílové tkáně, buňky se stanou díky tvorbě nanopórů trvale propustnými. Výsledkem je, že buňky nejsou schopny opravit poškození a umírají kvůli ztrátě homeostázy. N-TIRE je jedinečný pro jiné techniky ablace nádorů v tom, že nezpůsobuje tepelné poškození tkáně kolem něj.
H-FIRE Novější technika, která byla v poslední době vyvinuta, se nazývá vysokofrekvenční nevratná elektroporace (H-FIRE). Tato technika využívá elektrody k aplikaci bipolárních výbojů elektřiny o vysoké frekvenci, na rozdíl od N-TIRE, která využívá unipolárních výbojů elektřiny o nízké frekvenci. Tento typ zákroku má stejnou úspěšnost ablace nádoru jako N-TIRE. Má však oproti ní jednu výraznou výhodu, H-FIRE nezpůsobuje u pacienta svalovou kontrakci, a proto není potřeba paralytické činidlo. Navíc bylo prokázáno, že H-FIRE produkuje předvídatelnější ablace díky menšímu rozdílu v elektrických vlastnostech tkání při vyšších frekvencích.
Reverzibilní elektroporace Naopak k reverzibilní elektroporaci dochází, když je elektřina aplikovaná elektrodami pod prahem elektrického pole cílové tkáně. Protože použitá elektřina je pod prahem buněk, umožňuje buňkám opravit jejich fosfolipidovou dvojvrstvu a pokračovat ve svých normálních buněčných funkcích. Reverzibilní elektroporace se typicky provádí, pokud je třeba při léčbě vpravit lék nebo gen (nebo jiné molekuly, které za normálních okolností nejsou pro buněčnou membránu dostatečně permeantní) do buňky. Ne všechny tkáně mají stejný práh elektrického pole; proto je třeba před léčbou provést pečlivé výpočty, aby byla zajištěna bezpečnost a účinnost.
Jednou z hlavních výhod použití N-TIRE je to, že pokud je provedena správně, striktně podle pečlivých výpočtů, ovlivňuje pouze cílovou tkáň. Proteiny, extracelulární matrix a kritické struktury, jako jsou krevní cévy a nervy, nejsou tímto ošetřením ovlivněny a zůstávají zdravé. To umožňuje rychlejší zotavení a usnadňuje rychlejší nahrazení mrtvých nádorových buněk buňkami zdravými.