vpravo|náhled|401x401pixelů| Výroba DNA vakcíny. DNA vakcína je typ vakcíny, která transfekuje specifickou genetickou informaci DNA do antigenu prezentujících buněk jako mechanismus k vyvolání imunitní odpovědi.
DNA vakcíny fungují tak, že se podá v injekci geneticky upravený plazmid obsahující sekvenci DNA antigenu (antigenů), proti kterému je hledána imunitní odpověď, takže buňky přímo produkují antigen, čímž způsobují ochrannou imunologickou odpověď. DNA vakcíny mají oproti konvenčním vakcínám teoretické výhody, včetně „schopnosti vyvolat širší škálu typů imunitní odpovědi“. Několik DNA vakcín bylo testováno pro veterinární použití. V některých případech byla u zvířat vytvořena ochrana před nemocemi, v jiných nikoli. Stále probíhá výzkum ohledně přístupu k léčení virových, bakteriálních a parazitních onemocněních lidí a také ohledně možností léčby různých nádorů. V srpnu 2021 vydaly indické úřady povolení pro nouzové použití společnosti ZyCoV-D. Vakcína byla vyvinuta společností Cadila Healthcare a jedná se o první DNA vakcínu schválenou pro lidi.
Historie Konvenční vakcíny obsahují buď specifické antigeny z patogenu, nebo oslabené viry, které aktivují imunitní odpověď u očkovaného člověka. DNA vakcíny patří mezi genetické vakcíny, protože obsahují genetickou informaci (DNA nebo RNA), která podněcuje buněčnou produkci (biosyntézu proteinu) antigenu. DNA vakcíny obsahují DNA, která podněcuje k vytváření specifických antigenů z patogenu. DNA je do těla vpravena injekčně a následně přijata buňkami, jejichž normální metabolické procesy syntetizují proteiny založené na genetickém kódu plazmidu, který přijaly. Protože tyto proteiny obsahují části aminokyselinových sekvencí, které jsou charakteristické pro bakterie nebo viry, jsou rozpoznány jako cizorodé. Poté, co jsou zpracovány hostitelskými buňkami a objeví se na jejich povrchu, imunitní systém je rozpozná. To vede k imunitní reakci. Alternativně může být DNA zapouzdřena v proteinu pro usnadnění vstupu do buňky.
V roce 1983 Enzo Paoletti a Dennis Panicali z newyorského ministerstva zdravotnictví vymysleli strategii výroby rekombinantních DNA vakcín pomocí genetického inženýrství transformací obyčejné vakcíny proti neštovicím na vakcíny, které mohou vytváří ochranu proti dalším nemocem. Změnili DNA viru kravských neštovic vložením genu z jiných virů (jmenovitě viru Herpes simplex, hepatitidy B a chřipky).US Patent 4722848 - Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus V roce 1993 Jeffrey Ulmer a spolupracovníci z Merck Research Laboratories předvedli, jak přímá injekce plazmidové DNA nesoucí chřipkový antigen do myší vytvořila u zvířat ochranu před následnou experimentální infekcí virem chřipky. V roce 2016 se začala testovat DNA vakcína proti viru Zika na lidech v americkém Národním institutu pro zdraví (NIH). Klinická studie byla naplánována tak, aby zahrnovala až 120 subjektů ve věku od 18 do 35 let. Nezávisle na této studii zahájily společnosti Inovio Pharmaceuticals a GeneOne Life Science testy další DNA vakcíny proti Zika v Miami. Vakcína amerického NIH se aplikuje do horní části paže vysokotlakou injekční stříkačkou. Výroba vakcín ve větších objemech zůstala k srpnu 2016 nevyřešena. V únoru 2014 probíhaly klinické testy DNA vakcín proti HIV.
V srpnu 2021 daly indické úřady nouzový souhlas vakcíně ZyCoV-D. Je to první DNA vakcína proti nemoci covid-19 vyvinutá společností Cadila Healthcare.
Aplikace Do května roku 2021 nebyly ve Spojených státech schváleny žádné vakcíny DNA pro použití u lidí. Několik experimentálních studií vedlo k úspěšnému vytvoření dostatečně silné ochrany před různými nemocemi, užitečnost těchto vakcín je však stále třeba prokázat na dalších klinických studiích u lidí. Veterinární DNA vakcína proti viru západonilské horečky na ochranu koní byla úspěšně schválena. Imunizace pomocí DNA je mimo jiné zkoumána v souvislosti s vývojem sér proti jedu. DNA imunizace může být použita také jako technologická platforma pro indukci monoklonálních protilátek.
Výhody Žádné riziko infekce Prezentace antigenu molekulami MHC I. i II. třídy Polarizace odpovědi T-buněk směrem k typu 1 nebo typu 2 Imunitní odpověď zaměřená na požadovaný antigen Snadný vývoj a výroba Stabilita při skladování a přepravě Nízké náklady Není potřeba syntézy peptidů, exprese a purifikace rekombinantních proteinů a použití toxických přídavných látek Dlouhodobá životnost imunogenu In vivo exprese genu zajišťuje, že se protein více podobá normální eukaryotické struktuře s doprovodnými posttranslačními modifikacemi.
Nevýhody Použití omezeno na proteinové imunogeny (není vhodné pro antigeny, které nejsou založeny na proteinech, jako jsou bakteriální polysacharidy) Riziko atypického zpracování bakteriálních a parazitních proteinů Riziko transfekce necílových buněk (například mozkových) při podávání nanočástic plazmidové DNA pomocí nosního spreje. Riziko křížové kontaminace při výrobě různých typů živých vakcín ve stejném zařízení
Plazmidové vektory
Vektorový design DNA vakcíny vyvolávají nejlepší imunitní odpověď, když jsou použity vektory s vysokou expresí. Jedná se o plazmidy, které se obvykle skládají ze silného virového promotoru, který řídí in vivo transkripci a translaci cílového genu (nebo komplementární DNA). Intron A může být někdy zahrnut pro zlepšení stability mRNA, a tedy pro zvýšení exprese proteinu. Plazmidy také zahrnují silný polyadenylační/transkripční terminační signál, jako jsou hovězí růstový hormon nebo králičí beta-globulinové polyadenylační sekvence. Polycistronické vektory (s více cílovými geny) jsou někdy vytvářeny tak, aby exprimovaly více než jeden imunogen nebo exprimovaly imunogen a imunostimulační protein.
Protože plazmid – nesoucí relativně krátký genetický kód do přibližně 200 kbp – je „vehikulum“ neboli nosič, ze kterého je exprimován imunogen, je nezbytná optimalizace vektorového designu pro maximální expresi proteinu. Jedním ze způsobů zvýšení proteinové exprese je optimalizace využití kodonů patogenních mRNA pro eukaryotické buňky. Patogeny mají často odlišný obsah GC než cílový druh, takže změna genové sekvence imunogenu tak, aby odrážela kodony běžněji používané u cílového druhu, může zlepšit jeho expresi.
Dalším hlediskem je výběr promotoru. Promotor SV40 byl konvenčně používán, dokud výzkum neprokázal, že vektory řízené promotorem viru Rousova sarkomu (RSV) měly mnohem vyšší míru exprese. V poslední době byla exprese a imunogenicita dále zvýšena v modelových systémech použitím bezprostředního časného promotoru cytomegaloviru (CMV) a retrovirového cis-regulačního transkripčního elementu. Další modifikace pro zlepšení rychlosti exprese zahrnují vkládání zesilujících sekvencí, syntetických intronů, adenovirových tripartitních vedoucích (TPL) sekvencí a modifikací polyadenylačních a transkripčních terminačních sekvencí. Příkladem DNA vakcínového plazmidu je pVAC, který používá promotor SV40.
Fenomén strukturální nestability je zvláště rizikový při výrobě plazmidů, DNA vakcín a genové terapii. Doplňkové informace náležející k plazmidovému základnímu řetězci se mohou podílet na široké škále jevů strukturální nestability. Dobře známé katalyzátory genetické nestability jsou přímé, invertované a tandemové repetice, které se vyskytují v mnoha komerčně dostupných klonovacích a expresních vektorech. Redukcí nebo úplnou eliminací vnějších genových sekvencí hlavního řetězce by tedy byla výrazně snížena náchylnost k takovým událostem a následně celkový rekombinantní potenciál plazmidu.
Mechanismus plazmidů Jakmile se plazmid vloží do transfekovaného buněčného jádra, dochází k zápisu peptidového řetězce cizího antigenu. Na svém povrchu buňka zobrazuje cizorodý antigen s molekulami histokompatibilního komplexu (MHC) třídy I a třídy II. Buňka prezentující antigen poté putuje do lymfatických uzlin a prezentuje antigenní peptid a kostimulační molekulu T-lymfocytu, čímž spouští imunitní odpověď.
Design očkovací vložky Imunogeny mohou být zacíleny do různých buněčných kompartmentů, aby se zlepšily reakce protilátek nebo cytotoxických T-lymfocytů. Vylučované antigeny nebo antigeny vázané na plazmatickou membránu jsou účinnější při vyvolávání imunitních odpovědí než cytosolové antigeny. Imunitní odpověď cytotoxických T-buněk lze posílit cílením na antigeny pro cytoplazmatickou degradaci a následným vstupem do hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) třídy I. Toho je obvykle dosaženo přidáním N-koncových ubiquitinových signálů.
Konformace proteinu může také ovlivňovat protilátkové odpovědi. „Uspořádané“ struktury (jako jsou virové částice) jsou účinnější než neuspořádané struktury. Řetězce minigenů (nebo epitopů MHC třídy I) z různých patogenů zvyšují cytotoxické reakce T-buněk na některé patogeny, zvláště pokud je zahrnut také epitop TH.
Podání vpravo|náhled| Techniky DNA vakcíny a genové terapie jsou podobné. DNA vakcíny byly zaváděny do živočišných tkání mnoha způsoby. V roce 1999 byly dva nejoblíbenější přístupy injekce DNA ve fyziologickém roztoku: pomocí standardní hypodermické jehly nebo pomocí aplikace genové zbraně. V průběhu let bylo zdokumentováno několik dalších technik.
Injekce fyziologického roztoku Injekce ve fyziologickém roztoku se normálně provádí nitrosvalově do kosterního svalu nebo intradermálně (ID) a doručuje DNA do extracelulárních prostor. Tomu lze napomoci buď 1) elektroporací ; 2) dočasným poškozením svalových vláken myotoxiny, jako je bupivakain ; nebo 3) použitím hypertonických fyziologického roztoku nebo sacharózy. Imunitní reakce na tuto metodu mohou být ovlivněny faktory, jako je typ jehly, zarovnání jehly, rychlost injekce, objem injekce, typ svalu, věk, pohlaví a fyziologický stav příjemce.
Genová zbraň Princip aplikace pomocí genové pistole spočívá v balistickém urychlení plazmidové DNA (pDNA), která je vstřelena do zlatých nebo wolframových mikročástic, které následně přenášejí genetickou informaci do cílových buněk. Jako urychlovač je použito stlačené hélium.
Podání pomocí povrchu sliznice Alternativy zahrnovaly aerosolovou instilaci holé DNA na slizniční povrchy, jako je nosní a plicní sliznice a lokální podávání pDNA do oka a vaginální sliznice. Doručení na povrch sliznice bylo také dosaženo použitím kationtových lipozomových preparátů DNA, biodegradabilních mikrokuliček, atenuovaných bakterií Salmonalla, vektorů Shigella nebo Listeria orálním podáním do střevní sliznice a rekombinantních adenovirových vektorů.
Polymerový nosič Pro podání DNA vakcíny je použito hybridní vehikulum složené z bakteriálních buněk a syntetických polymerů. Vnitřní jádro Escherichia coli a vnější plášť z poly(beta-aminoesteru) fungují synergicky pro zvýšení účinnosti tím, že řeší překážky spojené s dodáním antigen prezentujících buněk, které zahrnují buněčnou absorpci a osvojení, fagozomální únik a vnitrobuněčnou koncentraci jednotlivých složek. Testováním na myších bylo zjištěno, že hybridní vektor vyvolává imunitní odpověď.
ELI Imunizace Dalším přístupem k DNA vakcinaci je imunizace expresní knihovnou (ELI). Pomocí této techniky mohou být potenciálně všechny geny z patogenu dodány najednou, což může být užitečné pro patogeny, které je obtížné oslabit nebo kultivovat. ELI lze použít k identifikaci, které geny vyvolávají ochrannou odpověď. Tato technika byla testována pomocí bakterií Mycoplasma pulmonis, myším plicním patogenem s relativně krátkým genomem. I částečné expresní knihovny mohou vyvolat ochranu před následnou pokusnou nákazou.