Kontrola kvality (quality control, QC) představuje klíčový krok při analýze dat ze single-cell RNA sekvenování (scRNA-seq), který slouží k odstranění dat z poškozených buněk a technických artefaktů. Mezi nejčastěji sledované metriky (číselné ukazatele) patří počet genů detekovaných v jedné buňce, celkový počet transkriptů a podíl mitochondriální genové exprese.

Mitochondriální exprese Podíl mitochondriálních genů udává procento transkriptů pocházejících z mitochondriální DNA v rámci jedné buňky. Zvýšené hodnoty této metriky jsou obvykle spojeny s buněčným stresem, poškozením nebo apoptózou. Buňky s vysokým podílem mitochondriální exprese jsou proto při analýze často odstraňovány, aby nedocházelo ke zkreslení výsledků. Ve většině případů je tolerovaná hranice mitochondriální exprese nastavována na 5–10% v závislosti na daném typu analýzy.

Filtrace buněk Jednou z možností jak odfiltrovat nežádoucí buňky je aplikace prahových hodnot pro jednotlivé metriky.

Typicky jsou odstraněny buňky:

s nízkým počtem detekovaných genů (např. < 200–500). Může se jednat o buňky mrtvé nebo poškozené či technický artefakt. s extrémně vysokým počtem genů (možné dvojice buněk, tzv. doublets). Případ, kdy mohou být dvě buňky chybně analyzovány jako jedna. s vysokým podílem mitochondriální exprese (např. > 5–15 %).

Konkrétní hodnoty se mohou lišit v závislosti na typu experimentu a organismu.

Implementace v R Analýza scRNA-seq dat je často prováděna v programovacím jazyce R s využitím balíčku Seurat, který umožňuje výpočet QC metrik a filtrování buněk.##Zobrazení rozsahu jednotlivých metrik pomocí funkce range #Funkce zobrazí jednotlivá rozmezí, která jsou následně využita pro jejich filtraci funkcí subset range(object name$nFeature_RNA) # Počet genů detekovaných v jedné buňce range(object name $nCount_RNA) # Kolik celkových transkriptů buňka má

# Výpočet procentuálního podílu mitochondriálních genů v každé buňce object name <- PercentageFeatureSet(object name, pattern = "^MT", col.name = "percent.mt") View(object name @meta.data) #Zobrazení dat z aktuálního Seurat objektu s novým sloupcem ,,percent.mt” range(object name $percent.mt) # Kolik % tvoří mitochondriální geny

# Vizualizace distribuce metrik kontroly kvality ve všech buňkách jako violin plot pomocí funkce VlnPlot VlnPlot(object name, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)

#Odfiltrování nežádoucích buněk pomocí funkce subset s využitím rozmezí z funkce range Object name <- subset(object name, subset = nFeature_RNA> 500 & nFeature_RNA< 4000 & nCount_RNA< 20000 & percent.mt< 10) #Nastavení rozmezí (z předem provedené funkce range viz řádky 3, 4, 9) následně zobrazených buněk # Vizualizace distribuce upravených metrik jako violin plot pomocí funkce VlnPlot VlnPlot(object name, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)

Reference

Kategorie:Molekulárně biologické metody