Referenční genom je standardizovaná referenční sekvence DNA (reference genome assembly), která poskytuje společný referenční rámec pro analýzu, anotaci a porovnávání genomových dat. Při analýze sekvenačních dat získaných metodami sekvenování nové generace (next generation sequencing, NGS) představuje souřadnicový systém, vůči němuž jsou zarovnávána sekvenační čtení a následně identifikovány genetické varianty. Referenční genom tvoří základ většiny bioinformatických analýz využívaných v genomice, molekulární biologii a klinické genetice. Jeho vývoj odráží technologický pokrok v sekvenování DNA i rostoucí poznatky o genetické diverzitě druhů.

Rozvoj metod sekvenování DNA v 90. letech 20. století umožnil vznik prvních referenčních genomů. Významným mezníkem bylo v roce 1995 publikování prvního kompletně osekvenovaného genomu samostatně žijícího organismu, bakterie Haemophilus influenzae. V následujících letech byly osekvenovány genomy dalších organismů, zejména modelových druhů.

Definice Referenční genom není jen referenční sekvencí DNA, ale především standardizovaným souřadnicovým systémem, který umožňuje jednoznačně popsat polohu genů, regulačních oblastí i genetických variant. Díky tomu lze výsledky různých bioinformatických analýz přímo porovnávat, sdílet a reprodukovat napříč laboratořemi, veřejnými databázemi i vědeckými studiemi.

Historie lidského referenčního genomu Historie lidského referenčního genomu úzce souvisí s Human Genome Project, jehož cílem bylo zmapovat a osekvenovat kompletní lidský genom. Přestože tato první verze podoby lidského genomu obsahovala řadu neúplných sekvencí (zejména v oblastech centromer, telomer a repetitivních sekvencí), představovala zásadní milník molekulární biologie a vytvořila základ pro další rozvoj moderní genomiky a bioinformatiky.

Následné aktualizace sekvence genomu koordinované Genome Reference Consortium (GRC) postupně vedly k sestavení dvou referenčních sekvencí – GRCh37 (ekvivalentní označení hg19) a novější GRCh38 (hg38). Poslední aktualizovanou publikovanou verzi lidského referenčního genomu představuje GRCh38.p14 z roku 2022. Snahy o vytvoření verze GRCh39 pak byly GRC „odloženy na neurčito“.

K dokončení lidské referenční sekvence významně přispělo Telomere-to-Telomere (T2T) Consortium, které vytvořilo referenční sekvenci T2T-CHM13. V této sekvenci bylo doplněno přibližně 8 % dosud neznámých úseků genomu, včetně dříve obtížně sekvenovatelných oblastí centromer a telomer.

Současný vývoj směřuje k vytvoření pangenomické referenční sekvence, která by reprezentovala globální variabilitu lidského genomu a snížila omezení spojená s používáním jediné referenční sekvence.

Využití referenčního genomu při analýze NGS dat Referenční genom je základní součástí většiny bioinformatických workflow využívajících NGS. Samotné sekvenování produkuje miliony krátkých nebo dlouhých sekvenačních čtení (reads), která neobsahují informaci o své původní poloze v genomu, proto se při bioinformatické analýze provádí jejich zarovnání (alignment, též mapping) vůči referenčnímu genomu. Výsledkem tohoto procesu je přiřazení genomových souřadnic jednotlivým sekvenačním čtením a určení jejich polohy v referenční sekvenci.

Na zarovnaná sekvenační data navazuje identifikace genetických variant (variant calling), při níž jsou porovnávány rozdíly mezi analyzovaným genomem a referenční sekvencí. Takto lze detekovat jednonukleotidové varianty (single nucleotide variants, SNV), inzerce a delece (indels) i některé rozsáhlejší strukturní varianty (delece, duplikace, inverze nebo translokace). Výsledné varianty jsou následně anotovány pomocí genomových databází a interpretovány s ohledem na jejich možný biologický nebo klinický význam.

Genomové souřadnice genů a genetických variant jsou vždy vztaženy ke konkrétní referenční sestavě (například GRCh37 nebo GRCh38). Při interpretaci výsledků je proto nezbytné uvádět, vůči které referenční sekvenci byly varianty určeny. Stejná genetická změna může mít v různých verzích referenčního genomu odlišné genomové souřadnice.

Příklad zápisu genetické varianty:

GRCh38 chr16:89 828 194 G>A

Tento zápis udává, že na chromozomu 16 se na pozici 89 828 194 referenčního genomu GRCh38 nachází v referenční sekvenci nukleotid G, který je u analyzovaného jedince nahrazen nukleotidem A.

Omezení referenčního genomu člověka Použití jediné lineární referenční sekvence může vést k tzv. referenčnímu zkreslení (reference bias), při kterém jsou sekvenační čtení podobná referenčnímu genomu zarovnávána přesněji než sekvence obsahující alternativní alely nebo rozsáhlejší strukturní varianty. Důsledkem mohou být nepřesnosti při identifikaci genetických variant, včetně falešně negativních nebo falešně pozitivních nálezů. Referenční zkreslení se výrazně uplatňuje zejména ve vysoce polymorfních oblastech genomu, například v oblasti genů hlavního histokompatibilního komplexu (major histocompatibility complex, MHC), kde může snižovat přesnost genotypizace. Omezuje také detekci strukturních variant, jako jsou delece, inzerce, duplikace, inverze nebo translokace, jejichž identifikace je závislá na správném zarovnání sekvenačních čtení vůči referenčnímu genomu.

Současné lidské referenční genomy vznikly postupným sestavováním genomových sekvencí několika anonymních dárců, což může být omezením při analýze geneticky odlišných populací nebo vysoce variabilních oblastí genomu. Za tímto účelem vzniku vzniklo např. Human Pangenome Reference Consortium kladoucí si za cíl vytvoření lidského pangenomu.

Reference

Kategorie:Genom