náhled|Spektrofotometr Spektrofotometrie je analytická metoda pro měření vlastností vzorku (např. koncentrace určité látky v roztoku) na základě pohlcování světla různých vlnových délek spektra. Pokud se měří jen při jedné vlnové délce, metoda se spíše označuje fotometrie. Obdobně zařízení, která měří při jedné nebo jen několika přesně definovaných vlnových délkách monochromatického světla, se nazývají fotometry. Technicky složitější a dokonalejší přístroje, které umožňují vlnovou délku monochromatického světla libovolně nastavit, nebo měřit část absorpčního spektra v určitém úseku vlnových délek, se nazývají spektrofotometry.
Princip spektrofotometrie Roztok v kyvetě je ozařován monochromatickým světlem (vybraná oblast elektromagnetického spektra) a světelné záření je molekulami analytu absorbováno. Detektor záření měří intenzitu dopadajícího světla (zářivý tok) neabsorbovaného roztokem. Při analýze je spektrofotometrem porovnávána intenzita zdrojem vysílaného záření s intenzitou záření dopadajícího na detektor – část energie světelného záření je roztokem a rozpuštěnými látkami absorbována. Množství absorbovaného záření je pak úměrné koncentraci látky ve studovaném roztoku.
Druhy spektrofotometrie Podle rozsahu absorbovaných vlnových délek se rozlišují tyto metody:
molekulová absorpční spektrofotometrie ve viditelné oblasti elektromagnetického spektra (frekvenční rozsah 400-800 nm) Molekulová absorpční spektrometrie v ultrafialové oblasti elektromagnetického spektra (frekvenční rozsah 190-400 nm) O absorpční spektrometrii v ultrafialové a viditelné oblasti blíže pojednává samostatný článek Ultrafialovo-viditelná spektroskopie.
molekulová absorpční spektrofotometrie v infračervené oblasti elektromagnetického spektra (frekvenční rozsah 0,8-1000 μm) O absorpční spektrometrii v infračervené oblasti elektromagnetického spektra blíže pojednávají samostatné články infračervená spektroskopie a blízká infračervená spektroskopie.
Pro měření ve viditelné oblasti spektra se používají skleněné, nebo občas i akrylové kyvety, pro měření v ultrafialové oblasti kyvety z křemenného skla. Pro měření v infračervené oblasti se používají kyvety z NaCl nebo TlBr.
Uspořádání a konstrukce fotometru náhled|Uspořádání spektrofotometru Principiálně se fotometr i spektrofotometr skládá ze čtyř částí: zdroj záření – halogenová žárovka, žárovka s wolframovým vláknem, xenonová lampa, vodíková výbojka, deuteriová výbojka, laser monochromátor – interferenční filtr, disperzní hranol nebo mřížka prostor, ve kterém je umístěn vzorek – kyveta detektor – fotonásobič nebo detektor s diodovým polem vyhodnocovací/zobrazovací zařízení – počítač, X-Y zapisovač (plotter), display zobrazující hodnotu měřené absorbance
Zdroj záření náhled|Rozsah vlnových délek viditelného světla a odpovídající barva Jako zdroj záření slouží vhodná žárovka nebo výbojka. Žárovky a halogenové žárovky poskytují záření o spojitém spektru ve viditelné a infračervené oblasti, nelze je však použít pro měření v ultrafialové oblasti. Jako zdroje ultrafialového záření se používají nejčastěji vodíkové nebo deuteriové výbojky. Zdrojem ultrafialového i viditelného světla může být také například xenonová výbojka, široký rozsah vlnových délek je však vyvážen některými nevýhodami: její záření je složením spojitého a čárového spektra, takže jsou velké rozdíly mezi intenzitami při různých vlnových délkách, výbojka je velmi drahá a intenzita jejího záření není příliš stabilní.
Monochromátor náhled|Šířka pásma a polopásma interferenčního filtru Polychromatické světlo následně prochází monochromátorem. Nejjednodušší a nejlevnější možností je zařazení vhodného interferenčního filtru do optické dráhy. Komerčně dostupné jsou dnes filtry prakticky pro libovolnou vlnovou délku ultrafialové a viditelné oblasti. Rozlišuje se několik druhů interferenčních filtrů, jejichž vhodnou kombinací se sestaví filtr požadovaných vlastností. Low-pass filtry propouštějí světlo vlnových délek kratších, než je určitá mez (cut-off). High-pass filtry naopak propouštějí jen světlo, které má větší vlnovou délku, než je hraniční vlnová délka filtru. Pásmové filtry propouštějí určitý rozsah vlnových délek. Protože hranice nebývají zcela ostré, uvádí se jako dolní a horní mez zpravidla taková vlnová délka, pro kterou má filtr padesátiprocentní transmitanci ve srovnání s vlnovou délkou, kterou propouští nejlépe. Někdy se také uvádí střední vlnová délka, kterou filtr propouští, a šířka pásma (nebo polopásma).
Jako monochromátor v současnosti obvykle slouží optická mřížka, jejímž nakláněním lze plynule měnit vlnovou délku (například Czerného-Turnerův monochromátor). Rozsah vlnových délek, které z monochromátoru vycházejí, určuje štěrbina, buď pevně nastavená, nebo rovněž nastavitelná. Čím je štěrbina širší, tím větší je intenzita vycházejícího světla, ovšem za cenu menší specifičnosti měření. Naopak užší štěrbina zajistí přesnější dodržení požadované vlnové délky, ovšem za cenu menší intenzity světla a zhoršení odstupu signálu od šumu.
Vzorek Monochromatické světlo prochází vzorkem. Většinou se pracuje s roztoky, které se plní do standardních kyvet s optickou dráhou 1 cm. Kyvety se v přístroji umisťují do kyvetátoru, který zajišťuje jejich přesnou polohu, může být temperován a někdy obsahuje i magnetickou míchačku, pomocí níž lze po vložení míchadélka do kyvety promíchávat její obsah během měření. Často bývá možné do kyvetátoru založit najednou několik kyvet, které se pak automaticky vsunují do optické dráhy.
Detektor Světlo vycházející ze vzorku dopadá na detektor, zpravidla fotodiodu nebo jiný fotoelektrický prvek. Intenzita se vyhodnotí pomocí systému převodníků, srovná se s intenzitou světla procházejícího slepým vzorkem, a tím se získá absorbance. Přesnost měření ovlivňuje integrační čas – doba, po kterou se absorbance měří. Čím je delší, tím přesnější bude výsledek měření, pokud ovšem není absorbující látka fotocitlivá (tedy pokud nedojde při delším osvitu k vyblednutí vzorku). Nevýhodou dlouhého integračního času je také prodlužování doby měření, což je podstatné zejména při zpracování velkého množství vzorků, při měření při velkém počtu vlnových délek (měření spekter), nebo při zpracování vzorků, které se v čase mění (kinetická měření).
Kromě jednopaprskových fotometrů, v nichž se nejprve měří slepý vzorek a pak se do stejné optické dráhy vkládá měřený vzorek, se používají i dvoupaprskové fotometry, které jsou vybaveny dvěma detektory a umožňují měřit slepý i měřený vzorek současně ve dvou optických drahách.
V případě dvojpaprskového uspořádání spektrofotometru dopadá orientovaný paprsek monochromatického světelného záření na dělič paprsku.Vznikají dva paprsky nové. Jeden nový paprsek prochází referentní kyvetou s rozpouštědlem a zářivý tok paprsku prošlého kyvetou je zaznamenáván detektorem záření. Druhý nový paprsek prochází kyvetou s roztokem vzorku (stejný druh rozpouštědla) a je zaznamenáván po průchodu kyvetou druhým detektorem. Spektrofotometr pak může porovnat absorbanci čistého rozpouštědla a měřeného roztoku.
Jednopaprskový spektrofotometr využívá pouze jeden detektor, nemá dělič paprsku. Toto konstrukční uspořádání spektrofotometru trpí nestabilitou zdroje záření.
Při stanovení koncentrace analytu se využívá tvorby kalibračních grafů. Měří se série kalibračních roztoků o vzrůstající koncentraci analytu. Ze změřené absorbance analytu ve zkoumaném roztoku se vypočte na kalkulačce jeho koncentrace.
Jiná uspořádání spektrofotometru Měření spektra na spektrofotometru s optickou mřížkou znamená, že přístroj změří absorbanci při jedné vlnové délce, pak posune mřížku, měří při další vlnové délce a to se neustále opakuje, dokud se neproměří celá požadovaná oblast. To s sebou přináší poměrně dlouhou dobu měření, což může být na závadu z několika důvodů:
vzorek se může v čase měnit (zejména při kinetických měřeních) vzorek může být fotocitlivý, v průběhu měření dochází k jeho vyblednutí pokud se zpracovává více vzorků, které nejsou dostatečně stabilní, může být technicky obtížné zajistit stejné podmínky pro první a poslední vzorky měření trvá dlouho, výkonnost metody je nízká
Diodové pole náhled|Uspořádání spektrofotometru s diodovým polem Uvedené nedostatky odstraňuje jiné uspořádání spektrofotometru, měření pomocí diodového pole (diode-array). Při něm prochází vzorkem bílé světlo, které je až poté rozloženo na jednotlivé vlnové délky (zpravidla pomocí pevně postavené optické mřížky) a dopadá na destičku s velkým množstvím detektorů – fotodiod (odtud název diodové pole). Diodové pole je přitom umístěno tak, že na každou fotodiodu dopadá určitý (poměrně úzký – například 2 nm) rozsah vlnových délek. Zařízení neobsahuje žádné pohyblivé prvky, což zvyšuje reproducibilitu měření, a navíc se změří celé spektrum najednou. Doba měření se tak může zkrátit z několika minut na zlomky sekundy. Toto uspořádání navíc umožňuje konstruovat přístroje přibližně o řád přesnější, než klasické fotometry, navíc nevyžadující prakticky žádnou údržbu, kalibraci atd. Zásadní nevýhodou bývá mnohonásobně vyšší pořizovací cena, avšak se zlevňováním miniaturních elektronických prvků se náklady na výrobu diodového pole rychle snižují.
Fotometrie se svislým paprskem V rutinním použití má klasické uspořádání fotometrie i další nevýhody: vyžaduje velké množství vzorku má malou výkonnost, zpracování jednotlivých vzorků je pracné kyvety jsou drahé a náročné na údržbu spektrofotometry jsou nákladné
Tyto nevýhody z velké části odstraňuje měření v mikrotitračních destičkách pomocí fotometru se svislým paprskem (čtečka destiček, plate reader). Vzorky se plní do polystyrénových destiček s 96 jamkami, existují ale i jiné formáty (od 4 do 384 jamek). Pro práci s mikrotitračními deskami jsou k dispozici speciální pomůcky (vícekanálové pipety, opakovací pipety atd.), které výrazně urychlují přípravu vzorků. Na rozdíl od klasických fotometrů, v nichž se absorbance měří vodorovným paprskem a optická dráha je daná tloušťkou kyvety, probíhá v tomto případě měření pomocí svislého paprsku a délka optické dráhy záleží na výšce hladiny v jamce. Pokud ke vzorku přidáme určité množství bezbarvého roztoku, sníží se sice koncentrace absorbující látky, zároveň se ale úměrně zvýší hladina roztoku v jamce (prodlouží se optická dráha) a výsledná absorbance bude stejná. Naopak, pokud se ze vzorku odpaří část bezbarvého rozpouštědla, optická dráha se sice zkrátí, zato však stoupne koncentrace absorbující látky a absorbance se opět nezmění. Lze říci, že na rozdíl od klasické fotometrie, kde absorbance odpovídá koncentraci absorbující látky v roztoku, závisí absorbance při měření svislým paprskem na látkovém množství absorbující látky ve vzorku.
Pro fotometrii svislým paprskem je třeba mnohem menší objem vzorku – jamky se zpravidla plní jen 100 až 300 μl roztoku. Mikrotitrační destičky jsou jednorázové a jsou vzhledem k počtu zároveň měřených vzorků podstatně levnější než plastové kyvety. Změření všech 96 jamek trvá obvykle jen několik sekund. Rovněž destičkové fotometry bývají poměrně levné, jako monochromátor většinou používají sadu interferenčních filtrů. Zvláště často se fotometrie svislým paprskem využívá v imunochemii, zejména v metodice ELISA (odtud rozšířené označení přístroje ELISA-reader).
Pro větší přehlednost se při fotometrii svislým paprskem kromě pojmu absorbance používá ještě termínu optická hustota (OD – z anglického optical density). Platí přitom vztah OD = A / l
kde OD je optická hustota, A je absorbance a l je délka optické dráhy.
Optická hustota tedy závisí jen na vlastnostech vzorku, nikoli však na délce optické dráhy, po níž světlo vzorkem prochází.
Reflexní fotometrie