El término química bioortogonal se refiere a cualquier reacción química que puede ocurrir dentro de los sistemas vivos sin interferir con los procesos bioquímicos nativos. El término fue por Carolyn R. Bertozzi en 2003. Desde su introducción, el concepto de reacción bioortogonal ha permitido el estudio de biomoléculas como glicanos, proteínas y lípidos en tiempo real en sistemas vivos sin toxicidad celular. Se han desarrollado varias estrategias de ligación química que cumplen con los requisitos de bioortogonalidad, incluida la cicloadición 1,3-dipolar entre azidas y ciclooctinas (también denominada química click sin cobre), entre nitronas y ciclooctinas, oxima / formación de hidrazona a partir de aldehídos y cetonas, la ligadura de tetrazina, la reacción click basada en isocianuro, y, más recientemente, la ligadura de cuadriciclano. miniaturadeimagen|Diagrama de una ligadura bioortogonal entre la biomolécula X y la pareja reactiva Y. Para ser consideradas bioortogonales, estas parejas reactivas no pueden perturbar otras funciones químicas que se encuentran naturalmente dentro de la célula. El uso de la química bioortogonal suele realizarse en dos pasos. En primer lugar, se modifica un sustrato celular con un grupo funcional bioortogonal (informador químico) y se introduce en la célula; los sustratos incluyen metabolitos, inhibidores enzimáticos, etc. El reportero químico no debe alterar drásticamente la estructura del sustrato para no afectar a su bioactividad. En segundo lugar, se introduce una sonda que contiene el grupo funcional complementario para que reaccione y etiquete el sustrato.
Aunque se han desarrollado reacciones bioortogonales eficaces, como la química click sin cobre, el desarrollo de nuevas reacciones sigue generando métodos ortogonales de etiquetado que permitan utilizar varios métodos de etiquetado en los mismos biosistemas. Bertozzi recibió el Premio Nobel de Química en 2022 por su desarrollo de la química click y la química bioortogonal.
Etimología La palabra bioortogonal procede del griego bio- "vivo" y orthogōnios "en ángulo recto". Por tanto, es literalmente una reacción que va perpendicular a un sistema vivo, por lo que no lo perturba.
Requisitos para la bioortogonalidad Para ser considerada bioortogonal, una reacción debe cumplir una serie de requisitos:
Selectividad: La reacción debe ser selectiva entre grupos funcionales endógenos para evitar reacciones secundarias con compuestos biológicos. Inercia biológica: Los agentes reactivos y el enlace resultante no deben poseer ningún modo de reactividad capaz de alterar la funcionalidad química nativa del organismo estudiado. Inercia química: el enlace covalente debe ser fuerte e inerte a las reacciones biológicas. Cinética: la reacción debe ser rápida para que se logre la ligadura covalente antes del metabolismo y la eliminación de la sonda. La reacción debe ser rápida, en la escala de tiempo de los procesos celulares (minutos) para evitar la competencia en reacciones que pueden disminuir las pequeñas señales de especies menos abundantes. Las reacciones rápidas también ofrecen una respuesta rápida, necesaria para realizar un seguimiento preciso de los procesos dinámicos. Biocompatibilidad de la reacción: las reacciones deben ser no tóxicas y deben funcionar en condiciones biológicas teniendo en cuenta el pH, los ambientes acuosos y la temperatura. La farmacocinética es una preocupación creciente a medida que la química bioortogonal se expande a modelos animales vivos. Ingeniería accesible: el reportero químico debe ser capaz de incorporarse en biomoléculas a través de alguna forma de ingeniería metabólica o de proteínas. Óptimamente, uno de los grupos funcionales también es muy pequeño para que no perturbe el comportamiento nativo.
Ligación de Staudinger La ligación de Staudinger es una reacción desarrollada por el grupo Bertozzi en el año 2000 que se basa en la clásica reacción de Staudinger de azidas con triarilfosfinas. Inauguró el campo de la química bioortogonal como la primera reacción con grupos funcionales completamente abióticos, aunque ya no se usa tanto. La ligadura de Staudinger se ha utilizado tanto en células vivas como en ratones vivos.
Bioortogonalidad La azida puede actuar como un electrófilo suave que prefiere nucleófilos suaves como las fosfinas. Esto contrasta con la mayoría de los nucleófilos biológicos que son típicamente nucleófilos duros. La reacción procede selectivamente en condiciones tolerantes al agua para producir un producto estable.
Las fosfinas están completamente ausentes de los sistemas vivos y no reducen los enlaces disulfuro a pesar del leve potencial de reducción. Se ha demostrado que las azidas son biocompatibles en medicamentos aprobados por la FDA, como la azidotimidina, y mediante otros usos como reticuladores. Además, su pequeño tamaño les permite incorporarse fácilmente a biomoléculas a través de rutas metabólicas celulares.
Mecanismo
Reacción clásica de Staudinger alt=The mechanism of the Staudinger reaction|centro|600x600px La fosfina nucleófila ataca a la azida en el nitrógeno terminal electrofílico. A través de un estado de transición de cuatro miembros, el N 2 se pierde para formar una aza-ilida. El iluro inestable se hidroliza para formar óxido de fosfina y una amina primaria. Sin embargo, esta reacción no es inmediatamente bioortogonal porque la hidrólisis rompe el enlace covalente en la aza-ilida.
Ligación de Staudinger alt=The mechanism of the Staudinger ligation using a modified triarylphosphine|centro|600x600px La reacción se modificó para incluir un grupo éster orto al átomo de fósforo en uno de los anillos de arilo para dirigir la aza-ilida a través de una nueva vía de reactividad con el fin de superar la hidrólisis inmediata posicionando el éster para aumentar la concentración local. El ataque nucleofílico inicial sobre la azida es el paso que limita la velocidad. La ilida reacciona con la trampa electrofílica del éster mediante ciclización intramolecular para formar un anillo de cinco miembros. Este anillo sufre hidrólisis para formar un enlace amida estable.
Limitaciones Los reactivos de fosfina se oxidan lentamente con el aire en los sistemas vivos. Además, es probable que sean metabolizados in vitro por las enzimas citocromo P450.
La cinética de las reacciones es lenta con constantes de velocidad de segundo orden alrededor de 0.0020 m−1 •s −1 . Los intentos de aumentar las tasas de ataque nucleofílico agregando grupos donantes de electrones a las fosfinas mejoraron la cinética, pero también aumentaron la tasa de oxidación del aire.
La escasa cinética requiere que se utilicen altas concentraciones de fosfina, lo que conlleva problemas de elevada señal de fondo en aplicaciones de imagen. Se han hecho intentos para combatir el problema del alto fondo mediante el desarrollo de reactivos fluorogénicos de fosfina basados en fluoresceína y luciferina, pero la cinética intrínseca sigue siendo una limitación.
Química click sin cobre La química click sin cobre es una reacción bioortogonal desarrollada por primera vez por Carolyn Bertozzi como una variante activada de una cicloadición de azida alquino Huisgen, basada en el trabajo de Karl Barry Sharpless et al. A diferencia de la CuAAC, la química de clic sin Cu se ha modificado para que sea bioortogonal mediante la eliminación de un catalizador de cobre citotóxico, lo que permite que la reacción se produzca rápidamente y sin toxicidad para las células vivas. En lugar de cobre, la reacción es una cicloadición alquino-azida promovida por cepa (SPAAC). Se desarrolló como una alternativa más rápida a la ligadura de Staudinger, con las primeras generaciones reaccionando más de sesenta veces más rápido. La bioortogonalidad de la reacción ha permitido aplicar la reacción de clic sin Cu en células cultivadas, peces cebra vivos y ratones. alt=click chemistry labeling|centro|600x600px|haga click en etiquetado químico
Toxicidad del cobre La clásica cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre ha sido una reacción click extremadamente rápida y eficaz para la bioconjugación, pero no es adecuada para su uso en células vivas debido a la toxicidad de los iones Cu(I). La toxicidad se debe al daño oxidativo de las especies reactivas de oxígeno formadas por los catalizadores de cobre. También se ha descubierto que los complejos de cobre inducen cambios en el metabolismo celular y son absorbidos por las células.
Se han desarrollado ligandos para prevenir el daño a las biomoléculas y facilitar su eliminación en aplicaciones in vitro. Sin embargo, se ha descubierto que los diferentes entornos de ligandos de los complejos pueden seguir afectando al metabolismo y la captación, introduciendo una perturbación no deseada en la función celular.
Bioortogonalidad El grupo azida es especialmente bioortogonal porque es extremadamente pequeño (favorable para la permeabilidad celular y evita perturbaciones), metabólicamente estable y no existe de forma natural en las células, por lo que no tiene reacciones secundarias biológicas competidoras. Aunque las azidas no son los 1,3-dipolos más reactivos disponibles para la reacción, se prefieren por su relativa falta de reacciones secundarias y su estabilidad en condiciones sintéticas típicas. El alquino no es tan pequeño, pero todavía tiene la estabilidad y la ortogonalidad necesarias para el marcaje in vivo . Los ciclooctinos son tradicionalmente los cicloalquinos más comunes para los estudios de marcado, ya que son el anillo de alquino estable más pequeño. alt=The mechanism proceeds through a standard 1,3-dipolar cycloaddition.|borde|derecha|350x350px
Mecanismo La reacción procede como una cicloadición dipolar 1,3 estándar, un tipo de desplazamiento pericíclico concertado asíncrono. La naturaleza ambivalente del dipolo 1,3 debería hacer imposible la identificación de un centro electrofílico o nucleofílico en la azida, de modo que la dirección del flujo cíclico de electrones no tiene sentido. Sin embargo, los cálculos han demostrado que la distribución de electrones entre los nitrógenos hace que el átomo de nitrógeno más interno tenga la mayor carga negativa.
Regioselectividad Aunque la reacción produce una mezcla regioisomérica de triazoles, la falta de regioselectividad en la reacción no es una preocupación importante para la mayoría de las aplicaciones actuales. Los requisitos más regioespecíficos y menos bioortogonales se satisfacen mejor con la cicloadición de Huisgen catalizada por cobre, especialmente dada la dificultad sintética (en comparación con la adición de un alquino terminal) de sintetizar un ciclooctino tenso.
Desarrollo de ciclooctinos CiclooctinoConstante de velocidad de segundo orden (m−1·s−1 )OCT0.0024ALO0.0013MOFO0.0043DIFO0.076DIBO0.057BARAC0,96DIBAC (ADIBO)0.31DIMAC0.0030 alt=Strained cyclooctynes developed for copper-free click chemistry|derecha|450x450px|Ciclooctinos tensados desarrollados para química click sin cobre El OCT fue el primer ciclooctino desarrollado para la química click libre de Cu. Mientras que los alquinos lineales no reaccionan a temperaturas fisiológicas, el OCT pudo reaccionar fácilmente con azidas en condiciones biológicas sin mostrar toxicidad. Sin embargo, era poco soluble en agua y la cinética apenas mejoró con respecto a la ligadura de Staudinger. El ALO (octino sin arilo) se desarrolló para mejorar la solubilidad en agua, pero aún tenía una cinética deficiente.