derecha| Cultivo de tejidos in vitro de plantas de patata. En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.
Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.Luis Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland. 2010. Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. En: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II, Argenbio, INTA. pags.: 70-84.ROCA W. M., MROGINSKI L. A. 1991, Cultivo de tejidos en la agricultura: fundamentos y aplicaciones. Ed. Centro Internacional de Agricultura Tropical, Colombia. Iniciación El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas, con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza, dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán a partir del explanto original dependen de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como tallos, raíces, bulbos u otros órganos. Estos tejidos cultivados in vitro se hallan dentro de un microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico, protegidos del medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo, que pueda entrar al mismo, crecerá de forma oportunista a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y finalmente colonizarán y matarán a los tejidos.
Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es «cultivar los tejidos», deben proveerse además ciertos requerimientos externos: los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o pueden colocarse en un medio líquido.
Algunos tejidos cultivados son lentos en su crecimiento. Para ellos habría dos opciones: (i) la optimización del medio de cultivo, (ii) El cultivo sano y creciendo vigorosamente tejidos o variedades. Pazuki, Arman and Sohani, Mehdi. 2013. Phenotypic evaluation of scutellum-derived calluses in ‘Indica’ rice cultivars . Acta Agriculturae Slovenica 101 (2): 239-247.doi:10.2478/acas-2013-0020. Necrosis podría estropear los tejidos cultivados. Generalmente, plantas variedades son diferentes en cultivo de tejidos de necrosis. De este modo, mediante el cultivo de forma saludable y creciendo vigorosamente variedades (o tejidos) se puede controlar.
Los tejidos también necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y una mezcla de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares.
Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo, en general, es necesario el suministro de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio de cultivo, más que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios altos niveles de luz.W.M. Morgan. Cultivo de tejidos vegetales. Universidad Nacional del Nordeste, Argentina.
Sistemas para los cultivos de tejidos En las últimas décadas se han desarrollado diferentes sistemas para los cultivos de protoplastos, células, tejidos y órganos vegetales; uno de ellos es el cultivo en suspensión (suspensiones celulares), el cual constituye una forma para mantener y propagar células vegetales. Descripción y manipulación de las suspensiones celulares. Las suspensiones celulares consisten en células libres y agregados celulares distribuidos en un medio en movimiento. Estas suspensiones pueden ser permanentes mediante el suministro continuo de nutrimentos.
Medios de cultivo Para el cultivo de suspensiones celulares de una gran variedad de plantas se ha utilizado el medio MS desarrollado por Murashige y Skoog (1962) para el cultivo de tejidos de tabaco, como también el medio B-5 de Gamborg et al. (1968). También se han utilizado otros medios, pero su composición no difiere mucho de los citados.
A menudo, los medios óptimos para la inducción y crecimiento de callos a partir de explantes primarios no son los mismos que para el establecimiento de suspensiones celulares; el nivel óptimo de auxinas y citocininas, p.ej. puede ser diferente .
En ocasiones las células en suspensión necesitan de suplementos orgánicos, aminoácidos, CH, extracto de levadura, y AC; la auxina más utilizada es 2,4-D.
Iniciación de las suspensiones Las suspensiones celulares se inician generalmente mediante la incubación de trozos de callos friables en medios líquidos que, están en movimiento continuo.
Comúnmente se emplean matraces Erlenmeyer, en los cuales se deposita el medio líquido con los trozos de callo dispersos en él, hasta llenar aproximadamente 1/5 de la capacidad de estos frascos; estos se ponen luego a incubar en un agitador giratorio a 80-150 rpm, bajo luz continua y a 25 °C de temperatura. Mediante subcultivos semanales, las suspensiones celulares quedan establecidas después de varios días.
Durante los primeros subcultivos es recomendable usar una tasa de dilución baja (por ej. 1:1 a 1:4) utilizando cuatro partes de medio fresco por cada parte de suspensión celular. Posteriormente se puede utilizar una tasa de dilución más alta, según el objetivo para el cual se haya establecido la suspensión.
Objetivos El cultivo de tejidos vegetales es utilizado como herramienta fundamental en un número importante de áreas y técnicas de la investigación y la producción vegetal, todas ellas relacionadas con lo que actualmente se conoce como biotecnología vegetal.
Más adelante se enumeran algunas de las más importantes: Estudios básicos de anatomía, desarrollo y nutrición vegetal. Variación somaclonal y gametoclonal a través de selección celular. Aislamiento de protoplastos. Utilizado para realizar fusión celular (hibridación somática) e ingeniería genética . Producción de plantas haploides a través de cultivo de anteras o cultivo de polen. Rescate de óvulos fecundados y embriones de cruzamientos interespecíficos e intergenéricos Ingeniería Genética: incluye todas las técnicas que utilizan organismos vivos o sus componentes para producir o modificar sus productos. La variedad de aplicaciones incluye las áreas de energía, manejo medio ambiental y productos farmacéuticos y agrícolas. Micropropagación vegetal. Propagación clonal o propagación in vitro o propagación vegetativa. Embriogénesis somática. Cultivo de meristemos para la eliminación de virus y enfermedades presentes en las plantas. Producción de fitoquímicos o producción de sustancias de metabolismo secundario.
Base biológica La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, las células de una planta poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametos. Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular y es característica de un grupo de células vegetales conocidas como células meristemáticas, presentes en distintos órganos de la planta. La potencialidad de una célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica) para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta. ArgenBio. 2007. Cultivo in vitro de plantas y su relación con la Biotecnología. Cuaderno 35. Por Qué Biotecnología?.
El éxito en la propagación de una planta depende de que se logre la expresión de la potencialidad celular, es decir, de que algunas células recuperen su condición meristemática. Para ello debe inducirse primero la desdiferenciación y luego la rediferenciación celular.
En condiciones naturales, un proceeso de este carácter sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias o cuando se busca la propagación de cualquier planta.
Entre los factores más importantes para lograr la respuesta morfogenética deseada se encuentra la composición del medio de cultivo. En todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de diferenciación está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Esos compuestos, denominados reguladores del crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una planta.
Historia La totipotencialidad celular fue enunciada como teoría por Gottlieb Haberlandt en 1902, quien propuso que todas las células vegetales tienen la capacidad de regenerar plantas completas.Haberlandt, G. (1902) Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Akad. Wiss. Wien. Math.-Naturwiss. Kl., Abt. J. 111, 69–92. Haberlandt no llegó a demostrar su hipótesis debido a que no pudo lograr la división celular ya que los medios de cultivo que empleaba no incluían reguladores del crecimiento debido a que esos compuestos eran desconocidos en ese momento.Bonner, J. 1936. Plant tissue cultures from a hormone point of view. Proc. Nat. Acad. Sci. 22: 426-430.White, P. R. Plant tissue cultures. The history and present status of the problem. Arch. exp. Zellf. 10: 501-518. 1931. En 1934, Philip White pudo mantener, en forma ilimitada, el crecimiento de raíces en medios líquidos a partir de ápices del tallo del tomate.White, P. R. POTENTIALLY UNLIMITED GROWTH OF EXCISED TOMATO ROOT TIPS IN A LIQUID MEDIUM. PLANT PHYSIOLOGY 3: 151-184.
Al mismo tiempo se identificó el ácido indolacético (AIA), que posibilitó el mantenimiento indefinido de callos de zanahoria y tabaco in vitro. Posteriormente se descubrió el efecto de la leche de coco como estimulante de la formación de callo sobre el cultivo de embriones de Datura stramonium. En 1948 Folke Skoog y Cheng Tsui, trabajando con cultivos de callo de tabaco, demostraron la existencia de una regulación química en la parte aérea y en la raíz.Skoog, F & Tsui, Ch. 1948. Chemical Control of Growth and Bud Formation in Tobacco Stem Segments and Callus Cultured in Vitro. American Journal of Botany Vol. 35, No. 10 (Dec., 1948), pp. 782-787 Trabajos posteriores en callos de la misma especie, con el agregado de cinetina, la primera citocinina descubierta, permitieron demostrar que la diferenciación de brotes, raíces o de ambos, estaba regulada por el balance de auxinas y citocininas.Silvia Radice. 2010. En: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II, Argenbio, INTA. pags.: 26-33.