Le transfert de protéines, en anglais (également appelé buvardage de western ou encore technique des immuno-empreintes)Voir l'article Transfert (biologie moléculaire) pour un complément sur la terminologie française., est une méthode de biologie moléculaire permettant la détection et l'identification de protéines spécifiques dans un échantillon biologique (sérum ou autre extrait ou homogénat tissulaire) à l'aide d'anticorps dirigés contre ces protéines que l'on souhaite détecter. Le western blot permet ainsi de visualiser des protéines particulières dans un mélange complexe. C'est l'une des techniques analytiques de transfert sur membrane utilisées en biochimie et en biologie moléculaire.
Elle est parfois utilisée comme un outil de diagnostic complémentaire pour mettre en évidence une protéine particulière (protéine virale, par exemple) dans le sérum d'un patient.
Technique vignette|Exemple d'un résultat de Western blot. Cette technique, née des progrès de la protéomique, de la biologie moléculaire et de l'Immunofluorescence, utilise l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour séparer des protéines, préalablement dénaturées, selon leur taille.
Ces protéines sont ensuite transférées depuis le gel sur une membrane (typiquement en nitrocellulose), où elles sont exposées à un anticorps spécifique de la protéine d'intérêt. Il est possible grâce à cette technique de détecter la présence d'une protéine dans un tissu, d'évaluer sa taille, sa concentration, les variations de cette concentration, effectuer des comparaisons de concentrations entre différents groupes, etc. D'autres techniques utilisant les anticorps permettent la détection de la protéine dans les cellules après fixation (immunocytochimie) et dans les tissus (immunohistochimie).
La méthode fut mise au point dans le laboratoire de George Stark à Stanford. Le nom du western blot, donné à la technique par W. Neal Burnette, est un jeu de mots à partir de la technique du Southern blot ou transfert de Southern, technique de détection d'ADN nommée d'après son inventeur, Edwin Southern et non d'après le point cardinal. La détection d'ARN est appelée northern blot ou transfert de northern. Toutes ces techniques dérivent leur nom de l'étape de transfert sur membrane, comparée à une empreinte sur buvard (blot = « tache » en anglais).
Différentes étapes du transfert de protéines
Préparation des échantillons Les échantillons (d'un tissu ou d'une culture cellulaire) sont rapidement refroidis, voire réfrigérés (en dessous de ). Ils sont homogénéisés par sonication (utilisation d'ultra-sons pour rompre les membranes), contrainte mécanique ou simplement lysés par utilisation de tampons à haute concentration en sels. Il en résulte un homogénat de tous les compartiments cellulaires, pouvant être utilisé tel quel ou être soumis à plusieurs étapes de centrifugation différentielle afin d'isoler les fractions cytosolique, nucléaire et membranaire. L'échantillon est ensuite traité de façon à recueillir un taux constant de protéines à partir de chaque échantillon différent. Cela implique un dosage des protéines par la méthode du Biuret ou du bleu de Coomassie (Méthode de Bradford).
Les échantillons sont ensuite bouillis de 1 à 5 minutes dans une solution tampon d'électrophorèse (par exemple le tampon de Laemmli), contenant une substance tampon, généralement du Tris, un colorant, un composant sulfhydryl (typiquement du beta-mercaptoéthanol ou du dithiothréitol ou plus simplement DTT), un détergent anionique lipophile (sodium dodécyl sulfate ou SDS) et du glycérol pour diminuer la poussée d'Archimède. La poussée d'Archimède entraine, un corps plongé dans un fluide, verticalement vers le haut. L'ébullition dénature les protéines en brisant les faibles liaisons intramoléculaires, ce qui a pour conséquence de les dérouler complètement. Le SDS leur procure alors un environnement riche en charges négatives afin de les solvater et prévenir la précipitation, et le composant sulfhydryl empêche la regénération des ponts disulfure. Le glycérol augmente la densité de l'échantillon par rapport au tampon dans la partie supérieure du réservoir du gel, facilitant la mise en place des échantillons qui descendront plus facilement au fond des compartiments du gel.
Électrophorèse sur gel Les protéines de l'échantillon sont séparées selon leur taille par électrophorèse sur gel, dont la composition varie en fonction du laboratoire, du poids moléculaire des protéines d'intérêt et des tampons disponibles. Les gels de polyacrylamide sont les plus fréquents. Les protéines ne traversant le gel que dans une dimension (du haut vers le bas), les échantillons sont chargés l'un à côté de l'autre dans des puits formés dans le gel. Les protéines sont séparées par masse en « bandes » dans chaque « couloir » formé sous les puits. Un couloir est réservé à un « marqueur » ou « échelle standard », une mixture de protéines possédant des poids moléculaires définis disponibles dans le commerce.
Il est également possible d'employer un gel 2D qui, à partir d'un seul échantillon, permet de faire migrer les protéines dans deux dimensions. Les protéines sont alors séparées par leur point isoélectrique (c'est-à-dire le pH auquel leur charge nette est neutre) dans la première dimension, et selon leur poids dans la seconde.
La composition d'un tampon d'électrophorèse (running buffer) pour western blot est d'un volume de tampon TGS (Tris-glycine-SDS) dilué 10 fois dans 9 volumes d'eau distillée.
Transfert sur membrane alt=Membrane de nitrocellulose|vignette|Membrane de nitrocellulose après transfert des protéines depuis le gel. Les protéines sont rendues visibles par coloration au rouge Ponceau S. Cette coloration est réversible par lavage et n'empêche pas l'interaction ultérieure avec des anticorps. Afin de rendre les protéines accessibles à la détection par anticorps, elles sont transférées depuis le gel sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF. La membrane est placée face-à-face avec le gel, et un courant électrique est appliqué aux grandes plaques sur l'un des deux côtés. Les protéines chargées migrent depuis le gel vers la membrane en conservant l'organisation relative qu'elles avaient dans le gel. Il résulte de ce transfert que les protéines sont exposées sur une surface mince, ce qui facilite les étapes de détection ultérieures. Tant les membranes de nitrocellulose que de PVDF sont « collantes », liant des protéines de manière non spécifique (c'est-à-dire qu'elles lient toutes les protéines présentes dans l'échantillon de la même façon). La fixation des protéines à la membrane se fait grâce à des interactions hydrophobes et ioniques entre la membrane et les protéines. Bien que les membranes de nitrocellulose soient moins chères que celles en PVDF, elles sont moins solides et ne peuvent être employées plusieurs fois. À la différence de celles en nitrocellulose, les membranes de PVDF doivent être imbibées de méthanol ou d'isopropanol à 100 % avant leur utilisation.
La composition pour un litre d'un tampon de transfert type est de : 700 mL d'eau distillée 100 mL de tampon TG (Tris-glycine) concentré 10 fois 200 mL de méthanol (produit toxique substituable par de l'éthanol tout en conservant une bonne qualité de transfert) 4 mL de SDS
Coloration des protéines Cette étape visualise la protéine totale qui a été transférée avec succès à la membrane. La coloration des protéines permet à l'utilisateur de vérifier l'uniformité du transfert de protéines et d'effectuer une normalisation ultérieure de la protéine cible avec la quantité réelle de protéines par voie. La normalisation avec le soi-disant "contrôle interne" a été basée sur l'immunocoloration des protéines constitutifs ou des protéines de structure (comme l'actine ou la tubuline) dans la procédure classique, mais se dirige vers la coloration des protéines totales récemment, en raison des avantages multiples. Au moins sept approches différentes pour la coloration des protéines totales ont été décrites pour la normalisation des Western blot: Ponceau S, stain-free technique, Sypro Ruby, Epicocconone, Coomassie R-350, Amido Black et Cy5. Afin d'éviter le bruit du signal, la coloration des protéines doit être effectuée avant le blocage de la membrane. Néanmoins, des colorations post-anticorps ont également été décrites.
Blocage La membrane ayant été choisie pour ses propriétés de liaison non spécifique, comme tant la protéine-cible que les anticorps sont des protéines, des précautions doivent être prises pour minimiser les interactions entre membrane et anticorps. Le blocage des sites d'interactions non spécifiques entre la membrane et les anticorps est réalisé en plongeant la membrane dans une solution diluée de protéines - le plus souvent de l'albumine de sérum bovin ou ASB (BSA en anglais) ou du lait sans matières grasses (lait dilué à 5 % - 5 g pour 100 ml) - en présence de détergent, typiquement du Tween 20), pendant une heure à température ambiante. Les protéines dans la solution diluée se lient à la membrane dans tous les sites non occupés par la protéine-cible. De la sorte, lorsque les anticorps sont appliqués lors de l'étape suivante, ils ne peuvent (idéalement) plus s'attacher à la membrane que sur les sites de liaison de la protéine-cible, ce qui réduit le « bruit de fond » dans le produit final du transfert de western, donne des résultats plus clairs et élimine les faux positifs.
Détection
Au cours de la détection, la membrane est « sondée » pour la protéine d'intérêt avec des anticorps, liés ensuite à une enzyme émettant un signal photométrique ou colorimétrique, ou bien des photons. Pour plusieurs raisons, ceci se produit classiquement en deux étapes, bien que des méthodes en une étape soient disponibles pour certaines applications.
Méthode en deux étapes Anticorps primaire
Les anticorps sont générés par inoculation à l'animal (généralement un lapin ou une chèvre) ou exposition d'une culture de cellules immunitaires à la protéine d'intérêt dans son intégralité ou seulement sur l'une de ses fractions (épitope). Toutefois, les protéines ayant été dénaturées lors de l'électrophorèse sur gel, il faut utiliser des anticorps qui reconnaissent spécifiquement la protéine dénaturée, et non la protéine native.
La réponse immunitaire normale est dans ce cas exploitée afin de générer des anticorps qui sont récoltés et utilisés comme outils de détection possédant à la fois une bonne sensibilité et une bonne spécificité, se liant directement à la protéine - d'où leur appellation d'anticorps « primaire ». Quelques anticorps monoclonaux, beaucoup plus difficiles à réaliser et dont l'affinité est beaucoup plus élevée peuvent également être utilisés en transfert de western.
Après le blocage, une solution diluée d'anticorps primaire (généralement comprise entre 0,5 et 5 micros grammes/ml) est incubée avec la membrane sous agitation modérée. La solution se compose typiquement d'un tampon salin proche du pH neutre (généralement, une faible quantité de chlorure de sodium), d'un petit pourcentage de détergent, et parfois de protéines (ASB ou lait 5 %) diluées. La solution d'anticorps et la membrane peuvent être scellées dans un sachet en plastique et incubées ensemble pour une durée allant de 30 minutes à une nuit. Elle peut aussi être incubée à différentes températures, les températures plus élevées étant associées à plus de liaisons plus spécifiques.
Anticorps secondaire