La focalisation isoélectrique (IEF de l'anglais isoelectric focusing ou electrofocusing) est une technique de séparation des molécules, telles que les protéines, par des différences dans leur point isoélectrique. C'est un type d'électrophorèse de zone.

Elle a des applications autant préparatoires qu’analytiques. Elle est principalement utilisée dans le domaine de la biochimie. Elle sert essentiellement à séparer les protéines les unes des autres en fonction de leur point isoélectrique unique.

Bien que les chercheurs Ikeda et Suzukion furent les premiers à remarquer que les acides aminés séparés d’une protéine formaient un gradient de pH lorsque placés entre deux électrodes, c’est au biophysicien russe Alexander Kolin que l’on attribue la plus grande contribution au développement de la focalisation isoélectrique. C’est en se basant sur les notions déjà appliquées à l’électrophorèse à son époque que l’ancien professeur de l’Université de Californie à Los Angeles a développé la focalisation isoélectrique en 1954. Cette technique est si étroitement liée à l’électrophorèse qu’on l’appelle aussi électrophorèse isoélectrique.

De plus, bien que l’exécution de cette technique était plutôt longue et fastidieuse à ses balbutiements dans le milieu des années cinquante, la focalisation isoélectrique est aujourd’hui l’une des techniques les plus utilisées pour la séparation et la caractérisation des protéines d’un mélange. En effet, grâce à son pouvoir de résolution inégalé et à sa compatibilité avec un large éventail de méthodes de séparations, l’électrofocalisation est présentement une méthode indispensable à quiconque entreprenant l’étude des protéines.

Principe de base

Le point isoélectrique Les séparations par IEF sont basées sur les propriétés de charge des molécules. Comme il a été mentionné lors de l’introduction, il s’agit plus particulièrement du point isoélectrique unique de chaque molécule qui est utilisé afin de les séparer et de les purifier à partir d’un mélange. En fait, le point isoélectrique se définit comme étant le pH spécifique où une molécule ne possède aucune charge électrique nette. C’est donc pour cette raison que l’IEF s’applique spécifiquement à la séparation de molécules amphotères qui peuvent agir à la fois comme un acide ou une base. Les acides aminés formant les protéines étant des zwitterions, soient « des espèces ioniques qui portent simultanément une charge positive et une charge négative », c’est pour cette raison que la focalisation isoélectrique est particulièrement utilisée afin de procéder à la séparation des espèces protéiques d’un mélange.

L'introduction d'un courant électrique Lors de la focalisation isoélectrique, c’est par l’introduction d’un courant électrique que la migration des espèces chargées est induite. En effet, une différence de potentiel est appliquée entre une anode et une cathode afin de faire migrer les molécules chargées positivement vers la cathode et celles chargées négativement vers l'anode. Par contre, la séparation des molécules protéiques d’intérêt ne peut être atteinte en l’absence d’un gradient de pH.

Le gradient de pH À un pH donné, soit à l’atteinte du point isoélectrique, les protéines se retrouvent nécessairement sans charge nette, celles-ci arrêtent de migrer sous l’effet du champ électrique induit. Alors, les protéines possédant toutes un point isoélectrique différent, celles-ci se concentrent dans une zone bien définie où le pH du gradient est égal à leur point isoélectrique. C’est donc la combinaison du gradient de pH avec le passage d’un courant électrique à travers l’analyte qui permet vraiment la séparation des polypeptides de ce dernier.

Le gradient de pH étant un paramètre clé de la focalisation isoélectrique, sa nature détermine largement la qualité de la séparation. Les deux principales façons d’obtenir un gradient de pH sont les suivantes:

Capillaire Le gradient de pH est généré à l’aide d’une solution tampon de plusieurs ampholytes ayant un point isoélectrique différent soumise à un courant électrique. Il est à noter que « les ampholytes sont des composés amphotères qui contiennent habituellement des groupements acide carboxylique et amine ». Il est d’ailleurs possible de préparer en laboratoire ces solutions aqueuses d’ampholytes couvrant des gammes de pH différents selon les molécules à séparer ou de se les procurer commercialement.

Avec cette technique, les analytes sont dissous dans une solution d’ampholytes dans un tube capillaire placé entre une cathode, où se trouve un électrolyte basique, et une anode, où se trouve un électrolyte acide. Une fois la tension constante appliquée aux bornes des électrodes, les cations, les anions et les différents ampholytes migrent d’un côté ou de l’autre de la cellule d’électrophorèse, les plus acides à l’anode et les plus basiques à la cathode, créant ainsi un gradient de pH dans lequel les analytes peuvent migrer, jusqu’à ce qu’ils atteignent une zone de pH où leur charge nette est nulle. Les différents analytes, habituellement de nature peptidique, arrêtent alors de migrer, puisque leur charge nette est de zéro, et ils sont alors séparés en fonction de leur point isoélectrique.

Cette méthode par capillaire permet d’utiliser un plus grand champ électrique puisque l’étroitesse du capillaire permet une diminution de la température plus rapidement. Un plus grand champ électrique permet de diminuer le temps de séparation de quelques minutes. Cette technique diminue également l’étalement des bandes par diffusion, ce qui les rendent plus nettes. Cependant, elle permet seulement de séparer une petite quantité de molécules. L’électrophorèse en capillaire a une bonne résolution et peut être automatisée, un peu comme la chromatographie en phase liquide à haute performance. Elle permet l’analyse d’une plus grande quantité de molécules, on peut analyser des protéines, des acides nucléiques, des peptides, des glucides, des cations, des anions, des vitamines, des pesticides des virus et même des cellules entières.

Sur gel Le gradient de pH mobile est généré dans le gel de polyacrylamide par les ampholytes liés aux unités d’acrylamides de façon à créer un gradient de pH d’un bout à l’autre du gel lors du passage d’un courant électrique. Il s’agit d’un gel synthétique qui peut être acheté commercialement.

Ce gel est préparé en utilisant des ampholytes, qui sont porteurs de charges et tout comme les protéines, possèdent des points isoélectriques différents. On doit soumettre un courant électrique aux ampholytes afin d’obtenir un gradient de pH qui augmente vers la cathode. Par la suite, la charge nette pour les ampholytes sera nulle, donc les molécules ne bougeront plus et on aura un gradient de pH immobile. Cette technique de la formation du gradient de pH permet d’obtenir un gradient qui est stable pour la séparation de molécules par focalisation isoélectrique.

Les ampholytes peuvent être également liés à l’acrylamide polymérisé afin de créer un gel avec gradient à pI immobilisé. Ce type de gel permet d’éviter un problème qui peut être présent lorsque l’on utilise la focalisation isoélectrique, soit la dérivation cathodique, où le gradient de pH va se désintégrer avec le temps. Cette méthode pour la formation du gradient permet donc une plus grande reproductibilité et permet l’analyse d’un plus grand nombre de molécules en même temps puisque le gradient de pI est plus stable. Un second phénomène qui peut changer le gradient de pH et la résolution est l’électroosmose. Cela est observé lorsque la matrice ou une partie de l’équipement qui sont en contact directe avec le gel portent une charge.

Avec cette méthode sur gel, l’échantillon liquide contenant les analytes peut être introduit à n’importe quel endroit sur le gel de polyacrylamide et les protéines migreront spontanément vers l’anode ou la cathode jusqu’à l’atteinte de leur point isoélectrique, en présence d’un courant électrique. Comme pour la technique précédente, les protéines seront alors séparées selon leur point isoélectrique.

Il est à noter que c’est le gel de polyacrilamide qui est le plus souvent utilisé de nos jours et que la focalisation isoélectrique est souvent couplée à l’électrophorèse sur gel 2D qui permet une meilleure séparation en fonction du poids de la molécule.

Mobilisation Une fois les protéines séparées en bandes lors de l’IEF, il est nécessaire de faire la détection des différentes protéines séparées afin d’en faire l’analyse. Pour ce faire, deux techniques sont utilisées afin de mener les protéines au détecteur se situant à l’une des extrémités d’un capillaire:

Mobilisation hydrodynamique Cette technique consiste à appliquer une différence de pression en direction du détecteur afin que s’écoulent les zones focalisées vers celui-ci. Il est à noter que cette technique a pour effet de mélanger les zones focalisées. Elle est donc plutôt inefficace.

Mobilisation chimique Cette technique consiste à modifier le gradient de pH dans le capillaire en ajoutant un sel neutre à l’une des deux électrodes, par exemple à l’anode, ce qui aura pour effet d’entraîner les bandes focalisées vers le détecteur à la cathode où le pH sera diminué. Ce sont les bandes ayant un point isoélectrique élevé qui seront détectées en premier.

De plus, lors de l’utilisation de la méthode d’IEF par gel, des marqueurs colorés ou l’absorption UV sont utilisés afin de détecter les protéines séparées. Il est à noter qu’il faut d’abord éliminer les ampholytes du gel avant de procéder au marquage, sans quoi les ampholytes seront eux aussi marqués.

Montage (sur gel)

Matrices Les gels pour la focalisation isoélectrique peuvent être achetés ou faits soi-même et il existe plusieurs longueurs et différentes variations pour le gradient de pH qui sert à avoir une meilleure séparation selon l’utilisation. Se procurer un gel provenant d’une compagnie spécialisée permet d’économiser du temps et permet également de s’assurer de la qualité du gel. Afin de choisir un gel approprié, voici quelques éléments qui peuvent aider : Utiliser une plus petite bande pour l’étude de la protéine la plus abondante. Une plus grande longueur permet d’avoir une plus grande résolution et aussi d’avoir plus de molécules en même temps sur le gel. Pour une désintégration totale des protéines, utiliser un gradient de pH de 3 à 10. Utiliser un petit écart de pH pour le gradient afin d’étudier une protéine désirée dont le pI est connu. Combiner des bandes avec des gradients qui se chevauchent pour une plus grande précision. Par exemple, une bande avec un gradient qui est de pH 4 à 7 et une autre qui a un gradient qui passe de 6 à 11. La polyacrylamide est la matrice la plus utilisée pour le gel de la focalisation isoélectrique. Cependant, on peut également utiliser un gel d’agarose qui permet d’avoir des pores de plus grande taille, permet une coloration et décoloration rapide et n’est pas toxique, contrairement au polyacrylamide qui provient de l’acrylamide, qui est toxique. Le gel d’agarose est utilisé pour l’électrophorèse des protéines et également des acides nucléiques.

Pour empêcher que la porosité n’affecte la vitesse de migration des petites protéines par rapport aux grosses, un gel d’une concentration en acrylamide de 5 à 6 pour cents est satisfaisant, sauf pour les protéines volumineuses, où il faut utiliser des concentrations en bas de 4 pour cent. Par contre, il est à noter que les gels ayant une concentration en acrylamide inférieure à 4 % sont très difficiles à manipuler, puisqu’ils sont très fragiles. Pour remédier à la situation, est possible d’ajouter de l’agarose pour augmenter légèrement la rigidité de la matrice sans influencer la mobilité des protéines.