thumb|upright=1.2|Principe d'utilisation de la puce à ADN. Une puce à ADN est un ensemble de molécules d'ADN fixées en rangées ordonnées sur une petite surface qui peut être du verre, du silicium ou du plastique. Cette biotechnologie récente permet d'analyser le niveau d'expression des gènes (transcrits) dans une cellule, un tissu, un organe, un organisme ou encore un mélange complexe, à un moment donné et dans un état donné par rapport à un échantillon de référence.
Les puces à ADN sont aussi appelées puces à gènes, biopuces ou par les termes anglais . Les termes français microréseau d'ADN et micromatrice d'ADN sont aussi des termes proposés par l'Office québécois de la langue française..
Le principe de la puce à ADN repose sur la propriété que possède l'ADN dénaturé (simple brin) de reformer spontanément sa double hélice lorsqu'il est en présence d'un brin complémentaire (réaction d'hybridation). Les quatre bases nucléiques de l'ADN (A, G, C, T) ont en effet la particularité de s'apparier deux à deux par des liaisons hydrogène (A = T et T = A ; G ≡ C et C ≡ G).
On parle de sonde (fragment d'ADN synthétique représentatif des gènes dont on cherche à étudier l'expression, fixé de façon covalente à la surface de la biopuce) et de cible (ARNm que l’on cherche à identifier et/ou à quantifier (échantillon)). Les cibles sont marquées par fluorescence (voir plus bas).
Les puces à ADN peuvent être utilisées pour mesurer/détecter les ARN qui seront traduits ou non en protéines. Les scientifiques parlent d'analyse d'expression ou de profil d'expression. Puisqu'il est possible de fixer jusqu'à un million de sondes sur une biopuce, les puces à ADN constituent ainsi une approche massive. Elles ont contribué à la révolution de la génomique, puisqu'elles permettent, en une seule expérience, d'avoir une estimation sur l'expression de plusieurs dizaines de milliers de gènes. Il existe également un grand nombre d'applications différentes qui font intervenir la technique des puces à ADN (criblage de mutations, reséquençage, interactions ADN/protéine, écologie microbienne).
Principe
En pratique, les ARN totaux sont extraits des cellules étudiées et subissent parfois une amplification qui va permettre d'obtenir une quantité de matériel génétique suffisante pour l'expérience. Ces ARNm sont ensuite transformés en ADN complémentaires (ADNc) par la technique de rétrotranscription et marqués. Ce marquage est aujourd'hui assuré par une molécule fluorescente (fluorochrome). Il existe deux fluorochromes majoritairement utilisés : la Cyanine 3 (Cy3) qui fluoresce dans le vert et la Cyanine 5 (Cy5) qui fluoresce dans le rouge. Les cibles ainsi marquées (ADNc) sont ensuite mises en contact avec la puce (portant l'ensemble des sondes à sa surface), cette étape est nommée hybridation. Chaque brin d'ADNc va alors s'hybrider aux sondes qui lui sont complémentaires pour former un duplex sonde/cible double brin. La biopuce est ensuite lavée par des bains spécifiques pour éliminer les brins d'ADNc ne s'étant pas hybridés car non complémentaires des sondes fixées sur la lame. La biopuce va ensuite être analysée par un scanner à très haute résolution, et ce à la longueur d'onde d'excitation de la Cyanine 3 ou de la Cyanine 5. L'image scannée est alors analysée informatiquement afin d'associer une valeur d'intensité à chaque sonde fixée sur la biopuce et ainsi de déterminer s'il y a eu une hybridation pour chaque sonde. alt= Les étapes d'une expérience de biopuce ADN|thumb|600x600px|Les étapes d'une expérience de biopuce ADN|centre Lors d'une expérience de biopuce ADN visant à comparer l'expression des gènes entre deux conditions (par exemple : cellule saine versus cellule malade), les ARN totaux des deux populations de cellules sont extraits et marqués chacun avec un fluorochrome différent. Les deux échantillons sont alors déposés simultanément sur la biopuce, on parle d'hybridation compétitive. Pour un gène donné, si le nombre de molécules d'ADNc correspondant à ce gène est plus important dans une condition que dans l'autre, l'hybridation entre ces ADNc et les sondes associées sera favorisée. Ainsi, après avoir scanné la biopuce aux deux longueurs des deux fluorochromes utilisés, il est possible de comparer l'intensité du signal vert et celle du signal rouge et donc de savoir, pour chaque gène étudié, dans quelle condition il est le plus exprimé.
Historique Les balbutiements des puces à ADN se font dès les années 1991 avec une publication de Stephen Fodor (scientifique américain et fondateur de la société Affymetrix) sur la technologie de synthèse in situ. S'ensuivent ensuite plusieurs événements qui entrent en ligne de compte : 1995 : Publication de Patrick Brown (biochimiste de l'université de Chicago) sur l’analyse de la transcription 1996 : Publication de Patrick Brown sur l’analyse de la transcription dans des cellules tumoralesDeRisi J, Penland L, Brown PO, Bittner ML, Meltzer PS, Ray M, Chen Y, Su YA, Trent JM. « Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. » Nat Genet. 1996, 14(4):457-60 1997 : Analyse globale de l’expression des gènes de la levureLashkari DA, DeRisi JL, McCusker JH, Namath AF, Gentile C, Hwang SY, Brown PO, Davis RW. « Yeast microarrays for genome wide parallel genetic and gene expression analysis.» PNAS, 1997, 94(24):13057-62 grâce à la technique des biopuces. 1999 : Création de la Microarray and Gene Expression Data (MGED) Society et premières analyses du transcriptome du cancer par l'équipe de Patrick Brown. 2001 : Création du projet MIAME (Minimum Information About a Microarray Experiment) qui décrit les conditions nécessaires à réunir pour assurer la réussite d'une expérience de biopuce ainsi qu'une fiabilité des résultats. 2002 : Développement de la technique NimbleGen Maskless Photolithography, la photolithographie étant utilisée dans les biopuces. 2004 : Développement de la technique des Randomly Ordered DNA Arrays
Utilisation et applications
Différentes techniques On distingue deux types d'analyses de biopuces : les biopuces à un canal : aussi appelées puces monochromatiques, ces puces permettent d'analyser un seul échantillon ou une seule condition par expérience. Néanmoins, elles ne permettent pas de connaitre le niveau d'abondance d'un gène dans l'absolu, mais plutôt une abondance relative en étant comparé à d'autres échantillons ou conditions au sein d'une même expérience. Cette comparaison de deux conditions du même gène demande deux hybridations monochromatiques distinctes. les biopuces à deux canaux : elles permettent la comparaison de deux échantillons, marqués par deux fluorophores différents, en une seule expérience. Elles reposent sur le principe d'hybridation compétitive entre les deux échantillons comparés. Une des forces de la biopuce à un canal réside dans le fait qu'un échantillon aberrant n'affecte pas l'analyse des autres échantillons. A contrario, chez les biopuces à deux canaux, il suffit d'un seul échantillon de mauvaise qualité pour diminuer drastiquement la qualité des résultats, même si l'autre échantillon cible est parfait. Une autre force est que les données d'une biopuce à un canal sont plus facilement comparées à d'autres biopuces provenant de différentes expériences. De plus, la biopuce à un canal est parfois la seule solution possible pour certaines applications.
Le tableau suivant est repris de la page anglophone de Wikipédia. Nom du procédé ou de la techniqueDescriptionExpression des gènesIl s'agit de l'utilisation la plus connue de la puce à ADN. On compare l'expression des gènes entre différentes conditions données ou au cours du temps. Grâce à l'hybridation et à une analyse d'image effectuée ensuite, ce procédé permet d'identifier quels gènes sont sur- ou sous-exprimés dans une condition donnée. Une fois ces gènes identifiés, d'autres analyses in silico sont nécessaires, telles que des analyses de clustering pour regrouper les gènes présentant le même profil d'expression. Enfin, les résultats seront souvent confirmés gène par gène par des méthodes telles que la PCR quantitative ou le Northern Blot. (méthodes d'analyse des gènes)Immunoprécipitation de chromatineLes biopuces peuvent aussi utiliser le phénomène d'immunoprécipitation de chromatine (Chromatin immunoprecipitation on Chip, ou ChIP-On-Chip). Ce procédé permet de déterminer la localisation du site de liaison de la protéine dans le génome.PolymorphismeLa puce à ADN peut aussi permettre de détecter du polymorphisme, c'est-à-dire d'identifier des polymorphismes ponctuels d’allèles au sein d’une population ou entre populations, prédire le développement de maladies au sein d'une population, évaluer les mutations ou encore analyser les liens entre gènes.TilingCes puces sont destinées à la recherche de nouveaux transcrits (on entend par là gène transcrit). C'est-à-dire que chaque segment de chromosome (pas seulement les gènes connus) est ciblé par une sonde. Un des intérêts est de découvrir de très nombreux ARN non codants (comme les ARN longs non-codants par exemple). On peut ainsi réussir à cartographier les transcrits, rechercher des exons, ou encore rechercher les facteurs de transcription.Biopuce à gène chimèreIl existe aussi des biopuces à gène chimère (ou gène de fusion). Le principe derrière est celui de l'alternative splicing en anglais, ou encore épissage alternatif en français. Une telle biopuce peut alors détecter les gènes transcrits par fusion, donc de spécimens de cancer.Hybridation génomique comparativeUne puce d'hybridation génomique comparative est une puce à ADN employée dans le but d'analyser les variations du nombre de copies dans l'ADN. Cette technique est principalement utilisée pour diagnostiquer les cancers et les maladies génétiques.GeneIDCes puces à ADN sont utilisées pour détecter certains types d'organismes dans la nourriture (comme des OGM), des mycoplasmes en culture cellulaire, ou certains agents infectieux pour diagnostiquer des maladies. La technique repose principalement sur la réaction en chaîne par polymérase.
Domaines d'applications La liste ci-dessous n'a pas vocation à être exhaustive, mais elle donne un panorama des domaines d'applications des biopuces. Biologie médicale de cancérologie : domaine de la cancérologie pour le typage tumoral d'après leur profil génétique. L'utilisation des puces à ADN comme outil de diagnostic présente l'avantage de faire appel à de nombreux marqueurs : plusieurs milliers de gènes peuvent être criblés simultanément pour fournir une signature du type cellulaire étudié. Si l'on considère que chaque type de tumeur présente une signature génétique unique, ce système permet virtuellement de distinguer et classer tous les types de tumeurs. Les puces à ADN permettent donc de comparer l'expression des gènes de deux types cellulaires différents (Réseaux de co-expression de gènes) , de faire de l'étude des gènes exprimés sur un grand nombre de patients pour observer l'effet d'un médicament (anti-cancéreux par exemple), de regarder l'effet d'un traitement sur l'expression des gènes, de comparer tissus sains contre tissus malades, traités contre non-traités, etc. Microbiologie : afin de définir les résistances aux antibiotiques, par exemple. Toxico-génomique : étude de l’influence de diverses substances toxiques sur l’expression des gènes. Les génotoxiques (comme le benzène, l'amiante, les rayonnements radioactifs, les rayonnements solaires, les produits cancérigènes, etc., ) sont visibles grâce au procédé des puces à ADN. En effet, les puces à ADN permettent d'analyser la réponse cellulaire à la présence de génotoxiques (au niveau du transcriptome). On étudie les effets sur un grand nombre d'individus, ces effets seront différents en raison du polymorphisme. Cette étude ouvre la porte à la pharmacogénomique. Génomique environnementale :