Un encima de restrición (tamén enzima de restrición) ou endonuclease de restrición é un encima que corta o ADN en puntos onde se encontran determinadas secuencias nucleotídicas específicas ou moi preto delas chamadas sitios de restrición. Os encimas de restrición son endonucleases que se clasifican xeralmente en tres tipos principais, os cales se diferencian na súa estrutura e na súa forma de cortar o ADN no seu sitio de recoñecemento ou restrición, ou na separación ou non entre os sitios de recoñecemento e clivaxe. Para cortar o ADN, todos os encimas de restrición fan dúas incisións, unha en cada cadea azucre-fosfato da dobre hélice do ADN.

Estes encimas encóntranse en bacterias e arqueas e para elas son un mecanismo de defensa contra os virus invasores. Dentro dunha célula procariota, os encimas de restrición cortan selectivamente o ADN alleo nun proceso chamado restrición; mentres que o ADN do hóspede está protexido por un encima modificador (unha metilase) que modifica o ADN procariótico e bloquea así a súa clivaxe (corte). En conxunto, estes dous procesos constitúen o sistema de restrición-modificación das bacterias.

Estudáronse en detalle uns 3.000 encimas de restrición, e pode dispoñerse comercialmente de máis de 600. Estes encimas utilízanse de forma rutineira para a modificación do ADN nos laboratorios, e son unha ferramenta fundamental na clonación molecular.

Historia O termo encima de restrición orixinouse nos estudos sobre o fago λ e o fenómeno da restrición e modificación controlado polo hóspede de virus bacterianos. O fenómeno foi descuberto nos laboratorios de Salvador Luria e Giuseppe Bertani a principios da década de 1950. Atoparon que un bacteriófago λ que pode crecer ben nunha cepa de Escherichia coli, por exemplo E. coli C, non crecía tan ben noutra cepa, por exemplo E. coli K, na cal o seu rendemento caía significativamente de 3 a 5 ordes de magnitude. A célula hóspede E. coli K, chamada hóspede restritor, parecía ter a capacidade de reducir a actividade biolóxica do fago λ. Se un fago se estabilizaba nunha cepa, a capacidade dese fago de crecer tamén se restrinxía noutras cepas. Na década de 1960, nos laboratorios de Werner Arber e Matthew Meselson atoparon que a restrición era causada por unha clivaxe encimática do ADN do fago, e o encima implicado denominouse en consecuencia encima de restrición.

Os encimas de restrición estudados por Arber e Meselson eran de tipo I, os cales clivan o ADN aleatoriamente fóra do sitio de restrición. En 1970, Hamilton O. Smith, Thomas J. Kelly e Kent Welcox illaron e caracterizaron o primeiro encima de restrición de tipo II, o HindII, da bacteria Haemophilus influenzae. Este tipo de encimas de restrición é máis útil para o seu uso nos laboratorios, xa que corta o ADN no sitio onde está a súa secuencia de recoñecemento. Máis tarde, Daniel Nathans e Kathleen Danna demostraron que a clivaxe do ADN do virus simio 40 (SV40) por encimas de restrición orixinaba fragmentos específicos que podían separarse usando electroforese en xel de poliacrilamida, o que indicaba que os encimas de restrición podían utilizarse para o mapado do ADN. O Premio Nobel de Medicina e Fisioloxía de 1978 concedéuselle a Werner Arber, Daniel Nathans, e Hamilton O. Smith polo seu traballo no descubrimento e caracterización de encimas de restrición. O seu descubrimento levou ao desenvolvemento da tecnoloxía do ADN recombinante que permitiu, por exemplo, a produción a grande escala de insulina humana para tratar a diabetes utilizando a bacteria Escherichia coli.

Orixe na evolución Os encimas de restrición e todo o sistema de restrición-modificación, probablemente evolucionaron a partir dun antepasado común que tiña un encima con actividade de endonuclease e outro de metilase, e despois espalláronse por transferencia horizontal de xenes. Ademais, hai cada vez máis evidencias de que as endonucleases de restrición evolucionaron como un elemento xenético egoísta.

Sitio de recoñecemento miniatura|dereita|Un sitio de recoñecemento palindrómico lese igual nas dúas cadeas, na cadea inversa e na cadea que se le cara a adiante, cando as dúas se len coa mesma orientación. Os encimas de restrición recoñecen unha secuencia de nucleótidos específica e produce un corte de dobre cadea no ADN, seccionándoo por completo. As secuencias de recoñecemento varían xeralmente en lonxitude entre 4 e 8 nucleótidos, e moitas delas son palindrómicas, o que significa que a secuencia de bases lese igual cara a adiante que cara a atrás. En teoría, hai dous tipos de secuencias palindrómicas posibles no ADN. O palíndromo de tipo espello é similar aos que se poden encontrar en textos escritos ordinarios, no cal unha secuencia se le igual cara a adiante que cara a atrás nunha soa febra do ADN, como en GTAATG. O palíndromo de tipo repetición invertida é tamén unha secuencia que se le igual cara a adiante que cara a atrás, pero as secuencias cara a adiante e cara a atrás están en febras de ADN complementarias nun ADN bicatenario, como en GTATAC (onde GTATAC é complementaria de CATATG). Os palíndromos de repetición invertida son máis comúns e teñen unha maior importancia biolóxica que os de tipo espello.

A dixestión polo encima de restrición EcoRI produce extremos que sobresaen e son complementarios entre si, e que se denominan extremos "pegañosos", "adherentes" ou "cohesivos",

90px

mentres que a clivaxe polo encima de restrición SmaI produce extremos "romos":

90px

As secuencias de recoñecemento no ADN difiren en cada encima de restrición, producindo diferenzas na lonxitude, secuencia e orientación da febra (o extremo 5' ou o extremo 3') dun extremo de ADN cohesivo que "sobresae" ou "colga" (é máis longa que a outra cadea).

Os distintos encimas (diferentes en procedencia, secuencia e estrutura) que recoñecen e clivan no mesmo punto denomínanse isoesquizómeros. Os diferentes encimas de restrición que recoñecen a mesma secuencia pero clivan en distintos puntos denomínanse neoesquizómeros.Definicións en Answers.com do Oxford Dictionary of Biochemistry e de McGraw Hill Science & Technology Dictionary

Tipos As endonucleases de restrición que se encontran na natureza clasifícanse en catro grupos, denominados tipos I, II, III e IV, baseándose na súa composición e nos cofactores encimáticos que precisan, a natureza da súa secuencia diana, e a posición do seu sitio de clivaxe no ADN en relación coa secuencia diana. Todos estes tipos de encimas recoñecen secuencias de ADN curtas específicas e realizan a clivaxe endonucleolítica do ADN producindo fragmentos específicos con 5'-fosfatos terminais. Difiren na súa secuencia de recoñecemento, composición de subunidades, posición de clivaxe, e requirimentos de cofactores, tal como se resume seguidamente:

Encimas de tipo I (), que clivan en sitios afastados do seu sitio de recoñecemento e requiren ATP e S-adenosil-L-metionina para funcionar. Son proteínas multifuncionais que teñen tanto actividade de metilase () coma de restrición. Encimas de tipo II () clivan no sitio de recoñecemento ou a unha curta distancia específica del; a maioría requiren magnesio. Só teñen unha actividade, a restrición, e son independentes de metilase. Encimas de tipo III (), que clivan en sitios que están a curta distancia do sitio de recoñecemento, e requiren ATP (pero non o hidrolizan); a S-adenosil-L-metionina estimula a reacción pero non é un requirimento. Forman parte dun complexo coa metilase de modificación (). Encimas de tipo IV recoñecen o ADN diana modificado, por exemplo ADN metilado, hidroximetilado e glicosil-hidroximetilado.

Ademais hai un tipo V que recoñece secuencias palindrómicas e utiliza ARNs guías.

Tipo I Os encimas de restrición de tipo I foron os primeiros que se identificaron e atopáronse primeiramente en dúas cepas de E. coli, a K-12 e a B. Estes encimas cortan nun sitio diferente do sitio de recoñecemento e que está a unha distancia variable del, a polo menos 1000 pares de bases de distancia. A clivaxe nestes sitios aleatorios segue un proceso de translocación do ADN, que indica que estes encimas son tamén motores moleculares. O sitio de recoñecemento é asimétrico e está composto de dúas porcións específicas, unha que contén 3–4 nucleótidos, e outra que contén 4–5 nucleótidos, separadas por un espazador non específico duns 6–8 nucleótidos. Estes encimas son multifuncionais e son capaces de realizar actividades de restrición e modificación, dependendo do status de metilación do ADN diana. Para a súa actividade plena necesitan os cofactores S-adenosil metionina (AdoMet), ATP (hidrolizado), e ións magnesio (Mg2+). Os encimas de restrición de tipo I posúen tres subunidades chamadas HsdR, HsdM, e HsdS; a subunidade HsdR requírese para a restrición; a HsdM é necesaria para engadir grupos metilo ao ADN do hóspede (actividade metiltransferase) e a HsdS é importante para a especificidade do sitio de recoñecemento (de unión ao ADN) ademais de para as actividades de restrición (clivaxe do ADN) e modificación (ADN metiltransferase).

Tipo II

Os encimas de restrición de tipo II típicos difiren dos de tipo I en varios aspectos. Son un homodímero, teñen os sitios de recoñecemento xeralmente non divididos e son palindrómicos e de 4–8 nucleótidos de lonxitude. Recoñecen e clivan o ADN no mesmo sitio, e non utilizan ATP ou AdoMet para a súa actividade, xeralmente requiren só Mg2+ como cofactor. Estes son os encimas de restrición dos que se dispón máis habitualmente. Na década de 1990 e a inicios da do 2000 descubríronse novos encimas desta familia que non seguían todos os criterios clásicos típicos desta clase de encimas, polo que se creou unha nova nomenclatura de subfamilias para dividir esta ampla familia en subcategorías baseándose nas desviacións das características típicas dos encimas de tipo II. Estes subgrupos defínense usando un sufixo de letras.

Os encimas de restrición de tipo IIB (por exemplo, BcgI e BplI) son multímeros, que conteñen máis dunha subunidade. Clivan o ADN a ambos os lados do seu sitio de recoñecemento cortando e separando todo o sitio de recoñecemento. Requiren AdoMet e Mg2+ como cofactores. As enconucleases de restrición de tipo IIE (por exemplo, NaeI) clivan o ADN despois de interaccionaren con dúas copias da súa secuencia de recoñecemento. Un dos sitios de recoñecemento actúa como diana para a clivaxe, e o outro actúa como un efector alostérico que acelera ou mellora a eficiencia da clivaxe realizada polo encima. Igual que os encimas de tipo IIE, as endonucleases de restrición de tipo IIF (por exemplo, NgoMIV) interaccionan con dúas copias da súa secuencia de recoñecemento pero clivan ambas as secuencias ao mesmo tempo. As endonucleases de restrición de tipo IIG (Eco57I) teñen unha soa subunidade, como os encimas de restrición de tipo II clásicos, pero necesitan o cofactor AdoMet para estar activos. As endonucleases de restrición de tipo IIM, como DpnI, poden recoñecer e cortar ADN metilado. As endonucleases de restrición de tipo IIS (por exemplo, FokI) cliva o ADN a unha distancia definida dos seus sitios de recoñecemento asimétricos non palindrómicos. Estes encimas poden funcionar como dímeros. De xeito similar, os encimas de restrición de tipo IIT (por exemplo, Bpu10I e BslI) están compostos por dúas subunidades diferentes. Algúns recoñecen secuencias palindrómicas, mais outros teñen sitios de recoñecemento asimétricos.

Tipo III